西林水牛和富鐘水牛mtDNA D-loop序列的遺傳多樣性研究

馬曉慧，王自豪，賈 鵬，雷初朝，廖玉英，黃光云*

(1.廣西壯族自治區畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧，530001；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌，712100)

水牛在動物學分類上屬于哺乳綱、偶蹄目、牛科、水牛屬。水牛屬包括非洲水牛亞屬和亞洲水牛亞屬[1]。現在世界上所有的家養水牛都是由亞洲水牛亞屬馴化而來。根據水牛的體型外貌、生活習性、細胞遺傳學和分子遺傳學等方面的不同，把家養水牛分為兩類，即江河型水牛(2n=50)和沼澤型水牛(2n=48)。中國水牛資源豐富，目前有24個沼澤型地方水牛品種，主要分布在中部和南部的18個省，特別在長江流域西南部和東南部的水稻種植區大量分布，在山東臨沂、陜西漢中、安康也有分布[2]。西林水牛和富鐘水牛是廣西壯族自治區重要的水牛品種，具有結構勻稱、體格粗壯、四肢強健、性情溫馴、役用性能好、耐粗飼、善爬坡、適應性和抗逆性強等特點[2]。

線粒體DNA遵循母系遺傳，進化速度快，變異主要來源于突變而非重組，可以真實地反映家畜的母系起源，在家畜的品種起源、遺傳分化和親緣關系等方面得到了廣泛應用，是物種鑒定和祖先母系起源研究的最佳標記之一[3]。Lei等[4]通過對中國6個水牛品種30個個體的mtDNA D-loop序列的研究，揭示中國沼澤型水牛由A和B 2個支系組成。Yue等[5]通過研究中國22個沼澤型水牛品種mtDNA D-loop序列的遺傳多樣性，提出支系A很可能在中國西南地區馴化而來。Zhang等[6]對中國、臺灣、越南、老撾、泰國、尼泊爾的沼澤型水牛的mtDNA D-loop序列進行分析，發現沼澤型水牛的遺傳多樣性高于江河型水牛，沼澤型水牛遺傳多樣性最高的地區是湄公河兩岸南部和印度支那北部，提出中國西南部與印度支那邊界地區是沼澤型水牛的馴化地。

本研究旨在通過分析西林水牛和富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列，以確定西林水牛和富鐘水牛的遺傳多樣性及母系起源，為其遺傳資源保護、開發和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與數據來源

采集廣西的西林水牛和富鐘水牛各30個個體的耳組織樣品，用75%乙醇保存帶回實驗室，-80 ℃超低溫保存。同時，從NCBI數據庫下載25條已公布的西林水牛和富鐘水牛的mtDNA D-loop序列。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增與測序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA，采用Kierstein[7]設計的引物擴增水牛mtDNA D-loop全序列。正鏈引物和反鏈引物分別為：F: 5'-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3'; R: 5'-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3'。PCR反應體系總體積為12.5 μL，擴增程序為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將PCR產物送西安生工生物工程有限公司進行純化與測序。

1.3 數據處理與統計分析方法

測序結果用Lasergene Seqman7.10軟件進行同源序列比對并進行人工校對，以確保其準確性。用DNASP 5.10[8]軟件統計單倍型數量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、核苷酸多態位點等。用MEGA7.0[9]構建水牛的NJ系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 西林水牛和富鐘水牛mtDNA D-loop區遺傳多樣性

對50頭西林水牛和35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列進行分析，其mtDNA D-loop全序列由A、T、C、G四種堿基組成，其中A堿基含量最高，為31.0%，其次為T和C堿基，分別為27.7%和26.3%，G堿基含量最少(15.0%)，A+T平均含量為58.7%，G+C平均含量為41.3%，A+T平均含量明顯高于G+C平均含量，表現出堿基的偏好性。

50頭西林水牛的mtDNA D-loop序列的單倍型多樣度為0.909±0.028，核苷酸多樣度為0.019±0.004；35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop單倍型多樣度為0.913±0.035，核苷酸多樣度為0.013±0.005，說明西林水牛和富鐘水牛具有豐富的遺傳多樣性。

在50頭西林水牛和35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop全序列中，共檢測到60個多態位點，包括57個轉換和3個顛換，其中C/T轉換有32個，A/G轉換有25個。這60個多態位點共定義38種單倍型(圖1)，其單倍型多樣度為0.917±0.022，核苷酸多樣度為0.017±0.004。

2.2 西林水牛和富鐘水牛的NJ系統發育樹

以一條黃牛(登錄號：AB177796)和一條江河型水牛(登錄號：EU268883)的mtDNA D-loop序列作為外群，用MEGA7.0軟件構建西林水牛與富鐘水牛38個mtDNA D-loop單倍型的NJ系統發育樹(圖2)。從NJ系統發育樹的聚類可以看出，這85頭水牛都為沼澤型水牛，且38個mtDNA D-loop單倍型明顯分為A、B兩大支系，A支系包括25個單倍型，代表61頭水牛，占71.76%(61/85)，B支系包括13個單倍型，代表24頭水牛，占28.24%(24/85)，說明西林水牛和富鐘水牛有A和B支系2個母系起源，但B支系的單倍型變異程度(54.17%，13/24)比A支系(40.98%，25/61)高。

圖1 富鐘與西林水牛38個mtDNA D-loop單倍型的多態位點

圖2 富鐘與西林水牛38個mtDNA D-loop單倍型的NJ樹

3 討 論

通過分析85頭富鐘與西林水牛mtDNA D-loop序列，發現其四種堿基A、T、G、C的含量分別為31.0%、27.7%、15.0%、26.3%，表現出堿基的偏好性，這是多細胞動物mtDNA D-loop序列的顯著特征[10]。A+T的平均含量為58.8%，G+C的平均含量為41.3%，顯然A+T的平均含量高于G+C的平均含量，而在山羊[11]、綿羊[12]、牦牛[13]、豬[14]、雞等[15]動物mtDNA D-loop區的研究結果也表明，mtDNA D-loop區的A+T的平均含量高于G+C的平均含量，說明動物mtDNA D-loop區的核苷酸含量在物種間有一定的相似性。本研究共檢測到60個變異位點，轉換有57個(占95%)，其中包含32個C/T 轉換，25個A/G 轉換；顛換有3個(占5%)，這一結果也符合哺乳動物 mtDNA 進化的特點[10]。單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量群體遺傳變異的一個重要指標，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說明群體的遺傳多樣性越豐富，反之，則說明群體的遺傳多樣性越低。前人已經有了大量關于水牛遺傳多樣性的研究，齊國強等[16]報道中國10個沼澤水牛群體的mtDNA D-loop序列的平均單倍型多樣度為0.8952±0.0240，平均核苷酸多樣度為0.0200±0.0056，表明了中國水牛的遺傳多態性豐富。謝文美等[17]計算出中國21個水牛群體mtDNA D-loop序列的平均單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.8460±0.0240和0.01403±0.00178，張自芳等[18]通過對滇東南水牛的研究得到其單倍型多樣度為0. 815±0. 066，核苷酸多樣度為0.01134±0.00306。本研究中，50頭西林水牛的單倍型多樣度為0.909±0.028，核苷酸多樣度為0.019±0.004，35頭富鐘水牛的mtDNA D-loop區單倍型多樣度為0.913±0.035，核苷酸多樣度為0.013±0.005。與前人研究相比，西林水牛和富鐘水牛的遺傳變異均高于中國水牛的平均水平，說明西林水牛和富鐘水牛具有豐富的遺傳多樣性。本研究的NJ系統發育樹顯示西林水牛和富鐘水牛聚為A支系和B支系，說明這兩個水牛品種有A支系和B支系兩個母系起源，與Lei等[19-20]所發現的中國水牛有兩個母系起源的觀點一致。西林水牛和富鐘水牛的A支系占71.76%，為主要支系，B支系占28.24%，為次要支系，但B支系的單倍型變異程度(54.17%)比A支系(40.98%)高，這與謝文美等[21]及Zhang等[6]分別對涪陵水牛和中國水牛mtDNA的研究結果一致，說明A支系水牛群體中的基因交流較B支系更頻繁。從mtDNA D-loop序列的研究結果來看，西林水牛與富鐘水牛的遺傳多樣性豐富，也沒有受到江河型水牛，如摩拉水牛和尼里拉菲水牛雜交改良的影響，且這2個品種的遺傳結構類似，建議廣西壯族自治區畜牧相關部門選擇其中1個水牛品種進行遺傳資源保護，另1個品種可以開發利用。