基于低共熔溶劑的液液微萃取技術測定食用油中的新煙堿類殺蟲劑

王素利，郭振福，庚麗麗

（河北北方學院 河北省農產品食品質量安全分析重點實驗室，河北 張家口 075000）

新煙堿類殺蟲劑是一類使用廣泛的高效殺蟲劑，目前有120多個國家登記[1]。其獨特優勢在于高效、選擇性、植物內吸性，而且成功克服許多害蟲對長期使用氨基甲酸酯、有機磷、擬除蟲菊酯等殺蟲劑產生的抗性，因此被廣泛使用于糧食、蔬菜和水果作物以及種子處理劑。據報道，煙堿類殺蟲劑對脊椎動物有較低急性毒性[2]。在哺乳動物實驗模型中，暴露于這些化合物可以誘導生物效應[3]，減少蜂群[4]，吡蟲啉可延緩小鼠胚胎[5]、雞胚[6]的發育，其代謝產物對脊椎動物有毒性[7]，啶蟲脒使鳥類精子密度明顯降低[8]，噻蟲啉對雞胚有致畸作用[9]，可能影響人類健康[10-12]。因此，不同國家制定了不同農產品，包括蔬菜和谷物中新煙堿類殺蟲劑的最大殘留限量。

食用油營養價值豐富，在日常生活中起著不可或缺的作用[13]。它能提供人體必需的脂肪酸，是脂溶性維生素的載體，能夠為人體提供需要的能量，維持正常體溫等作用[14-15]。大豆、油菜、向日葵、亞麻等產油作物使用大量殺蟲劑，植物油通過提取加工和浸著得到，農藥殘留仍可能發生在最終的食用油中，給人們健康帶來安全隱患。因此加強食用油的質量安全控制具有重要的意義[16]。歐盟、食品法典委員會、世界衛生組織制定了用于產油作物油籽中一些煙堿類的最大殘留限量為0.02～0.05 mg/kg[17]，GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》中也制定了一些煙堿類在油籽中的最大殘留限量為0.02～0.5 mg/kg。

由于食用油基質比較復雜，共提雜質多，必須經過凈化才能通過儀器檢測。液液萃取后經過EMR-lipid柱凈化[18]、基質固相分散[19]、QuEChERS[20]、分散固相萃取凈化[21]、冷凍法和分散固相凈化聯用[22]，這些方法費時，不能一步完成。目前，前處理方法正向著簡單、省時、小型化、減少有機溶劑的方向發展。分散液液微萃取是一種簡單快速的液相萃取方法[23-24]。傳統分散液液使用的提取溶劑密度較大、難溶于水，而且大部分是一些含氯溶劑，毒性較高、容易揮發，急需綠色溶劑替代[25]。低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）具有獨特優良的性質，同時生產成本低廉、合成路線簡單、可生物降解、無毒環保等優點，被認為是一種環境友好的綠色溶劑，可以作為溶劑替代分散液液微萃取技術中的傳統有機溶劑，在分散液相微萃取技術中具有潛在應用前景[26-28]。DES作為萃取溶劑在分散液液微萃取技術中用于食用油中的羥丙基苯丙類、酚類、三嗪類除草劑、雙酚A、木脂素的測定[29-33]，用于煙堿類農藥檢測鮮見報道。

本實驗利用氯化膽堿合成的綠色DES作為液相微萃取技術中的萃取劑，利用超聲波輔助分散，建立高效液相色譜測定食用油中4 種新煙堿類殺蟲劑的檢測方法，并且測定實際樣品中的4 種新煙堿類農藥，以期為油樣品中提取有機污染物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二醇、甘油、正己烷（均為分析純） 北京化學試劑公司；氯化膽堿（純度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉標準品（純度均大于98%） 中國標準物質有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜系統（配有二極管陣列檢測器）美國安捷倫公司；TDL-50B低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；WD-9415E型超聲波清洗器 北京市六一儀器廠；Nicolet IS5傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜測定條件

二極管陣列檢測器；波長254 nm；流速1 mL/min；Zorbax extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相分別為甲醇（A）和水（B）；梯度洗脫：0 min，10% A，90% B；10 min，40% A，60% B；15 min，80% A，20%B；20 min，10% A，90% B；進樣量20 μL。

1.3.2 DES的合成

以氯化膽堿作為氫鍵受體，乙二醇、甘油、尿素為氫鍵給體，按照物質的量比1∶2混合置于10 mL玻璃離心管中，在渦旋儀中渦旋混合直到形成均勻清澈透明的液體。即氯化膽堿-乙二醇、氯化膽堿-甘油、氯化膽堿-尿素DES。同時合成了氯化膽堿-乙二醇物質的量比1∶1、1∶3、1∶4的DES，并且保存在避光處備用。

1.3.3 超聲輔助分散液液微萃取操作過程

分別稱取10.0 mg標準物質于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成1 000 mg/L的單標，然后分別量取1 mL單標于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容為100 mg/L的混合標準貯備液，單標和儲備液均在-20 ℃保存。將儲備液用甲醇稀釋至適當質量濃度作為工作液，將混合標準儲備液稀釋到10 mg/L作為工作液用于樣品前處理。

1 mL食用油中添加一定質量濃度的混合煙堿類農藥標準溶液，渦旋混合均勻，然后用2 mL正己烷稀釋，加入50 μL的氯化膽堿-乙二醇（物質的量比1∶2）配成的DES，超聲分散5 min，形成渾濁液，3 000 r/min離心10 min，DES相沉積到試管底部，用注射器除去上層液體后，再向剩余物中加入2 mL正己烷，超聲分散5 min，3 000 r/min離心10 min，除去上層的正己烷洗滌液，殘余物用甲醇定容至1 mL，吸入內襯管中，進行液相色譜分析。

1.3.4 超聲輔助分散液液微萃取條件優化

為了優化萃取條件，在1 mL菜籽油中添加煙堿類農藥混合標樣，使添加質量濃度為50 μg/L。對影響萃取效率的影響因素進行優化，如食用油與正己烷比例、DES的種類和體積、萃取時間、離心時間等，每次實驗均在改變一個參數其他參數保持不變的情況下進行，每個實驗重復3 次。

1.3.5 方法有效性和確證

應用優化的超聲輔助分散液液微萃取方法進行線性、準確度和精密度測定。分別取一定量標準混合儲備液梯度稀釋為0.01、0.05、0.1、0.02、0.5 mg/L混合標準溶液進行線性測定。在菜籽油中添加一定量的工作液使添加質量濃度為50 μg/L，重復5 次，進行回收率和精密度（相對標準偏差（relative standard deviation，RSD））實驗。

從本地超市購買的葵花籽油、大豆油、胡麻油實際樣品用超聲輔助分散液液微萃取方法測定。為考察基質效應對該方法的影響，分別在3 種食用油中進行質量濃度20、50、100 μg/L和500 μg/L的添加回收率實驗，每個質量濃度重復3 次。

2 結果與分析

2.1 合成DES的傅里葉變換紅外光譜表征

圖1 氯化膽堿（A）、乙二醇（B）、氯化膽堿與乙二醇（1∶2）（C）的紅外光譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of choline chloride (A), ethylene glycol (B) and DES of choline chloride and ethylene glycol at 1:2 ratio (C)

DES的合成主要作用力是分子間形成氫鍵[27-28]，如圖1所示，純化膽堿氯、乙二醇在3 279、3 393 cm-1處的特征峰分別由O—H振動引起。在DES中乙二醇特征峰3 393 cm-1向3 377 cm-1移動，可能是由于氧原子上電子云向氫鍵的轉移。因此O—H振動的移動表明氫鍵的存在和DES的形成。

2.2 超聲輔助分散液液微萃取條件優化

2.2.1 油與正己烷比例

考察實驗樣品中食用油、正己烷的不同比例對分析物萃取效率的影響。按照1 mL菜籽油用正己烷1 mL或者2 mL稀釋，稀釋比例為1∶1和1∶2。圖2顯示氯化膽堿-乙二醇或氯化膽堿-甘油兩種DES萃取劑，2 mL正己烷稀釋的萃取效率均高于1 mL正己烷，表明菜籽油被2 倍體積正己烷稀釋后，萃取效果較好。

2.2.2 萃取劑DES類型的選擇

DES萃取劑的選擇對萃取效率影響非常重要[31]。以乙二醇、甘油、尿素作為氫鍵給體，氯化膽堿作為氫鍵受體，均以物質的量比2∶1混合制備的DES對菜籽油中的煙堿類殺蟲劑萃取。如圖3A所示，其他條件相同下，乙二醇與氯化膽堿形成的DES比甘油、尿素與氯化膽堿形成的DES萃取效率高。原因可能是由于甘油和氯化膽堿形成的DES的黏度高于乙二醇，阻止了目標分析物的傳質作用[34]。尿素形成的DES極性比乙二醇形成的小。從實驗結果看出乙二醇與氯化膽堿形成的萃取劑DES萃取效率最高，是最適萃取劑。

圖3 DES種類（A）和氯化膽堿-乙二醇比例（B）對萃取效率的影響Fig. 3 Effect of DES type (A) and choline chloride to ethylene glycol ratio (B) on the extraction efficiency

然后對氯化膽堿和乙二醇不同物質的量比形成的DES對萃取率的影響進行研究。如圖3B所示，當氯化膽堿-乙二醇物質的量比1∶2時回收率最大，由于在1∶1時黏度較大，不利于分析物的傳質，當比例再增大，極性太強，對極性較弱的吡蟲啉和噻蟲啉萃取率降低，因此，選擇氯化膽堿-乙二醇物質的量比1∶2的DES作為萃取劑，進行下一步實驗。

2.2.3 DES體積對萃取效率的影響

圖4 DES體積對萃取效率的影響Fig. 4 Effect of DES volume on the extraction efficiency

由上確定氯化膽堿和乙二醇1∶2的DES作為萃取劑，DES的體積對萃取效率具有一定的影響。本研究分別對25、50、75、100 μL和130 μL體積萃取效率進行實驗。由圖4可以看出，當DES體積大于50 μL時回收率逐漸減小，可能是體積增大稀釋所致。因此，在DES的體積為50 μL時萃取效率最高。

2.2.4 超聲萃取時間和離心時間的優化

圖5 超聲萃取時間對萃取效率的影響Fig. 5 Effect of ultrasonication time on the extraction efficiency

如圖5所示，隨著時間的延長，萃取效率不斷上升，當時間超過8 min，響應值不再上升，8 min萃取效率達到最高，說明在此時間內已達到飽和。離心的目的是使DES相與樣品進行有效分離，本實驗在1～20 min內轉速4 000 r/min條件下離心。結果表明，當離心時間為10 min時，回收率達到最高，時間延遲后，峰面積并未明顯變化，因此，離心時間選擇為10 min。

2.3 方法有效性評價

在已優化條件下對其線性、回收率、重復性、準確度、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）進行測定，所有實驗在菜籽油中進行，如表1所示。在0.01～0.5 mg/L內線性良好，相關系數大于0.99。添加質量濃度為50 μg/L時，重復5 次，回收率和RSD分別為81.9%～98.0%和5.5%～8.3%，LOD和LOQ以標準曲線最小質量濃度3 倍信噪比和10 倍信噪比計算，分別為3.2～5.3 μg/L和10.8～17.7 μg/L。

表1 4 種煙堿類殺蟲劑的線性方程、相關系數、LOD、LOQ、回收率和RSDTable 1 Linear calibration equations, correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of four neonicotinoid insecticides

2.4 樣品測定和方法驗證

用建立的超聲輔助分散液液微萃取方法測定市購樣品中的4 種煙堿類農藥，均未檢出。分別對市購樣品進行添加回收實驗，結果如表2所示，回收率在83.4%～100.8%之間，RSD在2.1%～8.2%之間。 結果表明，基質對萃取效果無顯著影響，該方法對測定實際食用油中新煙堿類殺蟲劑方法具有有效性和可行性，大豆油添加樣品色譜圖如圖6所示。

表2 4 種新煙堿類殺蟲劑應用超聲輔助分散液液微萃取在大豆油、葵花籽油和胡麻油中的添加回收率和RSD（n=3）Table 2 Recoveries and RSDs of new neonicotinoid insecticides spiked to soybean oil, sunflower seed oil and linseed oil at different concentrations (n= 3)

圖6 大豆油空白（a）和添加4 種煙堿類殺蟲劑樣品（b）色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of blank soybean oil (a) and sample spiked with four neonicotinoid insecticides (b)

2.5 超聲輔助分散液液微萃取與其他方法比較結果

表3 超聲輔助分散液液微萃取與其他方法比較Table 3 Comparison of the proposed UA-DES-LLM method with other methods for the determination of neonicotinoid insecticides

為了評價本實驗所建立的方法超聲輔助分散液液微萃取的有效性，與其他發表的檢測油樣品中目標分析物的方法進行比較，結果如表3所示。目前常用于植物油樣品中煙堿類農藥前處理方法主要是QuEChERS或者其改進方法，通常使用固相吸附劑PSA、C18、GCB等去除脂肪和雜質，改進方法使用Z-Sep、EMR-Lipid等增強去除油脂性能[36]，為了更好地去除油脂附加冷凍技術[36]。檢測大多使用液相色譜-質譜聯用技術，能夠進行多殘留檢測，由于單獨使用液相色譜LOD達不到要求[38]。本方法超聲輔助分散液液微萃取使用氯化膽堿和乙二醇合成的DES作為萃取劑，減少有毒有害有機溶劑使用。同時，DES較好的色譜行為節省了凈化過程，而且能夠用于液相色譜的檢測，方法更簡單，提取時間更短，得到的檢出限與公布方法的LOD相似或者更低。因此，本方法為植物油中煙堿類的檢測提供了另一種選擇。

3 結 論

本研究建立一種簡單、快速測定食用油中4 種新煙堿類殺蟲劑的超聲輔助分散液液微萃取萃取方法。對合成不同類型DES作為萃取劑的萃取效率進行研究。結果表明，由氯化膽堿和乙二醇物質的量比為1∶2形成的DES具有最佳的萃取性能。對影響萃取效率的主要因素進行優化，在最佳優化條件下，該方法具有良好的線性、滿意的回收率、重復性和較低的LOD，能夠滿足農藥殘留分析的要求。并且成功地應用于實際食用植物油樣品中4 種新煙堿類殺蟲劑的檢測，基質對萃取效果無顯著影響，該方法對測定實際食用油中新煙堿類殺蟲劑方法具有有效性和可行性。因此，超聲輔助分散液液微萃取具有成本低、簡單、快速、靈敏度高的特點，有望成為從油樣品中提取有機污染物潛在的液相微萃取技術。