UPLC-MS/MS法同時檢測食品中3 種主要牛奶過敏原

寧亞維，劉 茁，楊 正，馬俊美，范素芳，李 強,*，張 巖,*

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

近年來，食物過敏在世界范圍內迅速增加，已經成為一個備受關注的國際公共衛生問題[1]。牛奶過敏是常見的食物過敏之一，發病率在人群中分布廣泛，約0.3%～7.5%[2]。尤其是2 歲以下兒童發病率最高，這可能與嬰幼兒長期接觸以牛乳為原料的配方奶粉有關[3-4]。而牛奶營養豐富是食品加工中常用的原輔料，不同食品間共用生產線的不充分清潔會增加交叉接觸的可能性，增大過敏人群的暴露風險。對此許多國家已經制定了食品過敏原強制標識法規，以保護消費者免受食品過敏侵害[5-7]，某些特定產品中已經有“無牛奶”標簽[4,8]。而目前我國過敏原研究尚處于初始階段，僅在GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》和GB/T 23779—2009《預包裝食品中的致敏原成分》中推薦企業自行標識以提醒消費者[9-11]。因此，為降低牛奶過敏消費者的健康隱患，促進過敏原標識規范化和保障我國加工食品的出口貿易，建立可靠、靈敏的檢測方法十分必要。

目前，用于牛奶過敏原檢測技術主要有酶聯免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[12-14]法、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[15-17]法、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[18-20]法和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[5,21-22]法。目前，ELISA方法最為成熟，但由于各式各樣的食品熱加工手段會破壞目標蛋白質的空間結構，使目標致敏蛋白不能被特異性抗體識別，從而導致假陰性結果[23]。而PCR法是對致敏蛋白的DNA進行間接檢測，不受加工方式的影響，但核酸提取過程繁瑣，易發生污染出現假陽性。相比于傳統的PCR法，新興的LAMP法不僅簡化了復雜的操作流程，還可以達到更高的靈敏度，但仍面臨擴增產物易污染的問題[24-25]，且不能對復雜基質中的多種過敏原進行高通量檢測。近年來，LC-MS法被廣泛應用于牛奶過敏原的檢測[4,26-28]，可以有效解決ELISA的假陰性及PCR的假陽性弊端，如Lamberti等[4]采用質譜法檢測餅干中的αs1-酪蛋白，定量限（limit of quantitation，LOQ）為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]采用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g；Zhang Jingshun等[28]采用UPLC-MS/MS法檢測奶制品中的乳鐵蛋白，LOQ為3 μg/g。但其忽略了單一致敏蛋白在加工過程中熱變性或定量限等問題造成的假陰性。

基于質譜技術高通量檢測的優點，本實驗擬篩選牛奶過敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，開發一種UPLC-MS/MS法對食品中的β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白進行同時檢測，以期為食品中牛奶過敏原的標簽監管和準確定量提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉、配料中含牛奶和不含牛奶的8 種樣品 市售。

TPEVDDEALEK（96.69%）、VLVLDTDYK（97.26%）、YLGYLEQLLR（98.80%）、HQGLPQEVLNENLLR（95.83%）、FFVAPFPEVFGK（97.33%）、TVYQHQK（96.99%）、FALPQYLK（95.68%）、NAVPITPTLNR（99.91%） 上海強耀生物科技有限公司；β-乳球蛋白（90%，來源于牛乳）、α-酪蛋白（70%，來源于牛乳）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨、甲酸（均為質譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、乙腈（均為質譜純） 美國Fisher Scientific公司；TPCK-胰蛋白酶（生物級） 美國AB SCIEX公司；實驗室用水均為Watsons蒸餾水。

1.2 儀器與設備

超濾離心管（0.5 mL，10 kDa）、Easy-nLC 1000-Q Exactive納升液相色譜-串聯軌道阱高分辨質譜 美國Thermo Scientific公司；UPLC-Triple Quad 6500＋超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜（配電噴霧離子源及MultiQuant 3.0.1數據處理系統） 美國AB SCIEX公司；C18毛細富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18毛細分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?） 北京樂潤峰科技有限公司；Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm） 日本Shiseido公司。

1.3 方法

1.3.1 儲備液的配制

精密稱取TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、YLGYLEQLLR、HQGLPQEVLNENLLR、FFVAPFPEVFGK、TVYQHQK、FALPQYLK、NAVPITPTLNR各1 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成100 μg/mL的特征肽段混標儲備液。再分別稱取22.22 mgβ-乳球蛋白、28.57 mgα-酪蛋白標準品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2 mg/mL的標準蛋白儲備液。其中α-酪蛋白包括αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，且其含量比為4∶1。

1.3.2 樣品前處理

采用正己烷對富含脂肪的食品基質進行脫脂處理，取0.1 g樣品用蒸餾水稀釋至10 mL，取500 μL樣品稀釋液加入10 μL 500 mmol/L DTT溶液混勻，于70 ℃水浴反應30 min，然后加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液于室溫下避光靜置30 min。向上述混合液中加入420 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和30 μL 200 μg/mL TPCK-胰蛋白酶溶液混勻，于37 ℃水浴振搖酶解過夜，最后加入10 μL甲酸混勻以終止反應。酶解液于13 000×g離心10 min，取500 μL上清液于10 kDa超濾管中，14 000×g離心20 min，再取200 μL濾液于樣品瓶中待測。

1.3.3 設備參數

1.3.3.1 Easy-nLC 1000-Q Exactive測定條件

色譜條件：富集柱：C18毛細色譜柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18毛細色譜柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A，3%～7% B；3～38 min，93%～78% A，7%～22% B；38～48 min，78%～65% A，22%～35% B；48～50 min，65%～10% A，35%～90% B；50～60 min，10% A，90% B；流速300 nL/min；進樣體積2 μL。

質譜條件：電離源為電噴霧（正離子）離子源；掃描模式為Full MS/dd-MS2；全掃描分辨率70 000，AGC target為1×106，掃描范圍m/z350～1 800；dd-MS2分辨率17 500，AGC target為1×105，隔離窗口為m/z2.0，Fixed first mass為m/z120.0，碰撞能為27 eV。Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件相關參數：蛋白數據庫（bovine）從Uniprot數據庫進行下載（http://www.uniprot.org）；MS1質量范圍350～5 000 Da；最小峰數為1；水解酶為胰蛋白酶；允許漏切位點最多為2；肽段長度6～144；母離子質量誤差±10-6Da；碎片離子質量誤差±0.02 Da。

1.3.3.2 UPLC-Triple Quad 6500＋測定條件

色譜條件：色譜柱：Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，90% A，10% B；2～5 min，90%～80% A，10%～20% B；5～9 min，80%～78% A，20%～22% B；9～13 min，78%～70% A，22%～30% B；13～18 min，70%～25% A，30%～75% B；18～22 min，25% A，75% B；22～22.01 min，25%～90% A，75%～10% B；22.01～25 min，90% A，10% B；流速300 μL/min；進樣體積2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（正離子）；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子化電壓5 500 V；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度500 ℃。

1.3.4 方法學驗證

1.3.4.1 線性、LOD和LOQ

選擇面粉作為空白基質，向其中加入標準蛋白儲備液配制標準曲線，使其理論蛋白系列質量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。以特征肽段的色譜峰面積為縱坐標（Y）、以各組分的質量濃度為橫坐標（X）得到線性回歸方程。在空白基質中，添加標準蛋白儲備液，獲得定量特征肽段信噪比為3時，作為其對應過敏原蛋白的檢出限（limit of detection，LOD）；定量特征肽段信噪比為10時，作為其對應過敏原蛋白的LOQ，以μg/g表示。

1.3.4.2 基質效應

分別精密移取一定量的標準蛋白儲備液，用水稀釋配制，使其理論蛋白系列質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、30 000 ng/mL。

基質效應按下式計算：

式中：slopematrix為空白基質標準曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標準曲線的斜率。

1.3.4.3 加標回收率與精密度

向空白基質中添加標準蛋白儲備液進行回收率測定，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的具體添加量為25、100、500、5 000 ng/mL，每個質量濃度設置6 個平行實驗，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）以評估方法精密度。為排除基質對3 種過敏原蛋白定量產生的影響，標準曲線均采用添加標準蛋白的空白基質酶解液進行配制。

1.4 數據統計及圖表繪制

回歸方程及相關系數采用MultiQuant 3.0.1數據處理系統計算得出；色譜圖即為Analyst軟件原始提取離子流圖；采用Excel進行數據計算及分析。

2 結果與分析

2.1 特征肽段的篩選

牛奶中包括3.5%的蛋白質，主要分為兩大類：約占總蛋白質80%的酪蛋白和占20%的乳清蛋白[21]，其中含量豐富的α-酪蛋白（αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）和β-乳球蛋白被認為牛奶的主要過敏原成分[24,29]。且研究數據表明，IgE介導的牛奶過敏中60%的病人是對β-乳球蛋白過敏[30]，因此本實驗選擇β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白作為牛奶過敏原檢測的研究對象，其氨基酸序列見圖1。

圖1 β-乳球蛋白（A）、αs1-酪蛋白（B）和αs2-酪蛋白（C）氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequences of β-lactoglobulin (A), αs1-casein (B) and αs2-casein (C)

表1 牛奶過敏原鑒定所得全部肽段信息Table 1 Information about all peptides derived from milk allergens

β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白標準品經胰蛋白酶酶解后，采用Easy-nLC 1000-Q Exactive進行分析。結合Uniprot數據庫，將所得譜圖信息利用Thermo Proteome Discoverer 1.4軟件鑒定匹配。經數據分析后，3 種標準蛋白酶解液所得肽段信息見表1，β-乳球蛋白8 條肽段，肽段覆蓋率為40.4%；αs1-酪蛋白12 條，肽段覆蓋率為51.9%；αs2-酪蛋白13 條肽段，肽段覆蓋率為56.3%。然后根據以下特征肽段的篩選原則篩選特征肽段：肽段長度以7～20 個氨基酸為宜，肽段長度少于7 個氨基酸很難滿足其特異性，而長度過長不僅在實驗過程中易于斷裂且合成價格昂貴[26]；不含漏切或錯切的酶切位點，以保證肽段良好的可重復性；最好不含甲硫氨酸，因其易被氧化修飾[28]；進行定性定量分析時，具有較好的靈敏度和峰形[31-33]；經BLAST搜索后具有特異性。最終篩得8 條特征肽段，他們分別是β-乳球蛋白的VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK；αs1-酪蛋白的FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNENLLR和YLGYLEQLLR；αs2-酪蛋白的NAVPITPTLNR、FALPQYLK和TVYQHQK。

2.2 反應監測參數優化

將8 條特征肽段混標儲備液用水稀釋至5 000 ng/mL，通過蠕動泵以5 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500＋質譜儀中，通過全掃描模式確定特征肽段的前體離子精確質量數，再通過產物離子掃描從產物離子中選擇2 個穩定且靈敏度高的特征子離子，以建立MRM離子對。在MRM模式下優化各特征肽段的去簇電壓和碰撞能，見表2、圖2。根據各肽段靈敏度的高低，分別將VLVLDTDYK、FFVAPFPEVFGK和NAVPITPTLNR作為β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的定量肽段。

表2 牛奶過敏原特征肽段的MRM參數Table 2 MRM parameters of signature peptides derived from milk allergens

圖2 牛奶過敏原8 條特征肽段的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of eight signature peptides derived from milk allergens

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系和基質效應

表3 牛奶過敏原定量特征肽段的線性關系Table 3 Linear calibration equations for quantitative analysis of signature peptides derived from milk allergens

表4 3 種牛奶過敏原的LOD、LOQ和基質效應Table 4 LODs, LOQs and matrix effects of three milk allergens

牛奶過敏原β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質中的線性關系見表3，其在1.6～30 000 ng/mL的線性范圍內線性良好，R2均大于0.999。由表4可知，β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白LOQ分別為50、3.2 μg/g和40 μg/g。此外，由表4可得β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白在面粉基質中的基質效應分別為90.54%、86.04%和97.48%，均有不同程度的離子減弱作用，但并不明顯，均在20%以內，后續實驗均采用空白基質標準曲線補償基質效應。

傳統ELISA線性范圍窄，故實際樣品需要稀釋后再進行定量，但Monaci等[34]研究表明稀釋對ELISA法定量牛奶過敏原有顯著影響，此外Koeberl等[35]選取3 種市售ELISA試劑盒檢測羽扇豆，結果表明陽性樣品的假陰性率為50%、12.5%和33.3%，陰性樣品的假陽性率為33.3%、16.6%和25%，證明ELISA檢測方法的交叉反應及不準確性。PCR技術從DNA水平可有效解決復雜基質中帶來的檢測困難，但Villa等[15]研究基于β-乳球蛋白基因分別采用定性PCR和實時PCR檢測肉制品中牛奶過敏原，結果缺乏可重復性，LOD高達500 μg/g；賈敏等[17]基于GenBank基因建立實時定量PCR法檢測α-乳白蛋白，液體樣品LOD為1 000 copies/mL，但在實際樣品果粒奶優中無擴增曲線，尚不滿足痕量檢測。與此同時，以上方法均未涉及多重過敏原的同時檢測，而基于質譜技術的檢測方法，從特異性的肽段水平進行定量，準確性和靈敏度更高，但目前仍大多局限于單一牛奶過敏原的定量檢測，如Lamberti等[4]檢測餅干中的αs1-酪蛋白，LOQ為4 μg/g；Lai Shiyun等[27]檢測奶制品中的α-乳白蛋白，LOQ為50 μg/g。而本方法可以有效同時定量3 種牛奶過敏原，三者可以相互輔助定性牛奶成分的存在，LOQ最低為3.2 μg/g，可以對食品中的痕量牛奶過敏原進行檢測。

2.3.2 加標回收率與精密度結果

表5 牛奶過敏原的加標回收率和RSD（n=6）Table 5 Recoveries and RSDs of milk allergens from spiked samples (n= 6)

由表5可知，β-乳球蛋白的平均回收率在86.41%～97.59%之間，RSD不大于4.96%；αs1-酪蛋白的平均回收率在87.34%～98.60%之間，RSD不大于4.31%；αs2-酪蛋白的平均回收率在86.98%～92.76%之間，RSD不大于8.95%。相比于Qi Kailun等[36]采用LC-MS法在空白焙烤食物基質中αs1-酪蛋白平均回收率在65.2%～71.5%之間，αs2-酪蛋白的平均回收率在79.6%～86.1%之間，可見本方法回收率更加穩定，重復性高，可作為實際樣品的準確定量檢測方法。

2.4 實際樣品檢測結果

為評估本實驗所建方法的實用性，從當地超市隨機選取8 種實際樣品進行檢測，其中薯片、奶茶粉、小洋人和早餐包標簽信息中含有牛奶但無過敏原標簽提示，沙琪瑪、蛋黃派、餅干和面粉標簽信息中未標明含有牛奶成分且無過敏原提示。如表6所示，標簽信息中含有牛奶成分的4 個樣品均成功檢出β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，含量范圍分別為（5.502×102±9.451）～（2.402×103±132.4）、（4.917×102±3.484）～（1.003×104±199.1） μg/g和（2.998×102±5.053）～（3.398×103±31.47） μg/g，而不含牛奶的4 個樣品中3 種過敏原均未檢出。雖然結果并未檢出產品中潛在的牛奶過敏原，但不同生產線間的交叉污染現象仍不容輕視，而本方法可有效保障消費者食品安全，為企業的自檢提供技術支持，使其可自行標明其可能隱藏的過敏原成分，促進食品過敏原標識市場監管的進一步落實和強化。

表6 UPLC-MS/MS法檢測市售食品中牛奶過敏原含量Table 6 Contents of milk allergens in commercial foods determined by UPLC-MS/MS

3 結 論

基于β-乳球蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白的特征肽段，建立UPLC-MS/MS方法，在MRM模式下可用于快速篩查和定量食品中的牛奶過敏原。本方法通過同時檢測3 種主要的牛奶過敏原判斷食品中牛奶的存在，避免單一致敏蛋白在加工中的降解及定量限等因素導致的假陰性，LOQ分別為β-乳球蛋白50 μg/g、αs1-酪蛋白3.2 μg/g、αs2-酪蛋白40 μg/g。方法學實驗證實了本方法良好的準確性和重復性，可為我國牛奶過敏原的標簽標識管理及定量檢測提供技術支持，還可為其他過敏原的高通量檢測提供理論基礎。