灘羊肌肉在煮制過程中可揮發性化合物的變化

單啟梅，趙曉策，羅瑞明，尤麗琴

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

灘羊主產于寧夏鹽池縣，為國家二級保護畜種[1-3]。鹽池灘羊肉質細嫩，無膻腥味，脂肪分布均勻，風味獨特，深受廣大消費者的喜愛[4-7]。

肉加熱后不僅質構發生變化，風味前體物質經系列化學反應而產生香氣[8-9]。肉品在煮制過程中產生的揮發性風味物質種類較多，包括酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、芳香烴、酚類等，其中酸、醇、酯、酮、醛具有較低的閾值，對風味的形成具有重要作用，因此對食品中的揮發性風味物質進行檢測非常重要[10-11]。李偉等[12]采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定了灘羊肉可揮發性成分，共檢測出43 種揮發性風味物質。但目前對灘羊肉煮制過程中可揮發性化合物形成的溫度、時間及揮發性風味物質隨溫度時間變化的相關研究較少，使得寧夏手抓羊肉、清燉羊肉等特色灘羊肉制品工業化生產中風味控制技術的研發缺乏理論指導。

目前，對可揮發性化合物質研究大都采用GC-MS聯用技術對產品風味進行成分分析，但此技術無法分析鑒定出一些含量少而對風味至關重要的物質[13]。氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術將嗅味檢測儀與分離揮發性物質的GC相結合，能有效地從復雜的化合物中分析鑒定出氣味物質[14]。郝寶瑞等[13]采用GC-O-MS技術研究了清醬肉中可揮發性化合物，并分析各個物質對清醬肉整體風味的貢獻大小；蘇曉霞等[15]以菜籽油為研究對象，采用GC-O-MS技術確定該物質的特征風味物質，對菜籽油的香氣特征有了完整概念，并可以借此優化菜籽油的商品品質。所以將GC-MS和GC-O技術結合，優勢互補，對可揮發性化合物的分析鑒定起到更大的作用。風味物質在進行GC-MS檢測前，需對其進行分離和取樣，吹掃捕集（purge and trap，P&T）法具有高吸附率、對痕量物質敏感的特點，可較為完整地提取可揮發性風味成分[16]。本研究采用P&T結合GC-MS和GC-O技術，以灘羊肌肉為原料，研究在煮制過程中揮發性風味物質的形成及變化，旨在為研發肉品風味形成控制技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽池灘羊背最長肌 寧夏鹽池縣大夏農林牧開發有限公司；正構烷烴（C6～C26）標準品、2-甲基-3-庚酮Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

KT300數字溫度計 廣州潮州市潮安區保德儀器具有限公司；Trace MS GC-MS聯用儀 美國Finnigan公司；Atomx型吹掃捕集儀 美國Tekmar實業發展有限公司；Agilent DB5-MS-123-5533氣相毛細管色譜柱 上海邁隆科技有限公司；Tenax TA石英玻璃吸附毛細管 北京譜鵬科技有限公司；ODP2嗅聞檢測儀 德國Gerstal公司；DS-II型電熱三用恒溫水浴箱 余姚市亞星儀器儀表有限公司；FA系列電子天平 上海蒲春計量儀器有限公司；AUX HR50F多功能電熱鍋 廣東江門市威多福電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

隨機選取5 只體質量為（20.00±2.00）kg經草料喂養的6 月齡純種公灘羊，將5 只實驗羊現場屠宰，分別去除5 只羊背最長肌的皮下脂肪后采樣500.00 g。將其切成12 份（0.60 cm×0.60 cm×8.00 cm），4 ℃貯藏，待分析。

因短鏈脂肪酸熔點為44～55 ℃[17]，故本實驗將檢測溫度起始點定為50 ℃。將水（4.00 L）和8.00 g NaCl放入鍋中[18]，加熱并監測其中心溫度至50、60、70、80、90 ℃以及水煮沸后每20 min（0、20、40、60、80、100、120 min）分別取樣10.00 g。放入PE材質的自封袋中，為防止揮發性物質遺失，于冰浴中進行冷卻[19]，同時將其貯存在-18 ℃條件下直到取出分析檢測。

1.3.2 灘羊肌肉中脂肪酸提取與分析

精確稱取10.00 g灘羊肌肉，去除筋膜等后切成薄片，放入真空冷凍干燥機中干燥，待干燥后用粉碎機打碎，并用氯仿-甲醇溶液（87%氯仿）在索氏抽提器中提取10 h，然后將提取后的殘渣放入真空冷凍干燥機揮去殘留的有機溶劑，放入干燥器中備用。向樣品中加入5.00 mL的KOH-CH3OH溶液（0.50 mol/L），將樣品在70 ℃條件下皂化5 min，然后加入5.00 mL體積比為1∶3的BF3-CH3OH溶液，并將樣品在70 ℃條件下進行甲酯化2 min，再加入3.00 mL正己烷溶液，70 ℃條件下回流萃取1 min后，最后于樣品中加入飽和NaCl溶液5.00 mL，然后靜置10 min，分層吸取出1.00 mL上層液于進樣瓶中進行GC-MS分析，每組平行3 次實驗。

1.3.3 P&T-GC-MS技術分析檢測

參考郝寶瑞[13]、陳海濤[20]等方法，并進行適當調整。

剪碎研磨后取2.00 g灘羊肌肉裝置于40.00 mL P&T樣品瓶中，加入1.00 μL內標溶液（0.408 μg/μL的2-甲基-3-庚酮）和質量分數3%的NaCl溶液，使用自動P&T濃縮器以50.00 mL/min流速的氮氣將頂空物質吹掃出來，并吸附到裝有極性Tenax-TA吸附材料和非極性Agilent DB5-MS-123-5533氣相毛細管色譜柱的毛細管捕集器上。設定條件為60 ℃平衡25 min，氮吹流量為50 mL/min，吹掃吸附60 min。完成吸附過程。最后通過快速熱解吸，200 ℃解吸4 min，將解吸出的物質注入GC-MS儀進行分析。每組樣品平行3 次進樣。

GC條件：載氣為99.99%的氦氣，恒流量1.20 mL/min，入口溫度250 ℃，壓力14.87 Pa。分流比1∶1；初始柱溫40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min的速率升至200 ℃，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，并保持3 min。色譜毛細管柱為DB-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS傳輸線溫度280 ℃，質量掃描范圍m/z50～350。

1.3.4 灘羊肌肉的揮發性風味物質分析檢測

采用GC-MS分析提取灘羊肌肉樣品中揮發性成分，分析條件同1.3.2節，流出物在毛細管末端以1∶1的比例分別流入嗅聞儀和質譜檢測器。嗅聞儀端口選取經過專業聞香培訓的品評人員對本實驗的樣品進行GC-O分析和香氣提取物稀釋分析。

氣味檢測條件：嗅覺檢測端口（瑞士布雷赫布勒，嗅探器9000）。將界面溫度為150 ℃，并引入濕氮，以防止實驗人員弄干鼻子。

通過查找參考文獻，得到本實驗檢測到物質在水中的閾值，計算被測到表示該物質對整體氣味貢獻大小的氣味活性值（odor activity value，OAV），計算公式為：

式中：Cx為該物質含量/（μg/kg）；OTx為該物質的氣味閾值/（μg/kg）。

1.4 數據處理

根據積分色譜圖結果，在NIST 05a.L譜庫數據庫檢索，與標準譜圖對比進行定性分析，根據CAS號確定其化學成分及化學名稱，用峰面積歸一法計算化合物在灘羊肉揮發性風味物質中的含量（μg/kg）。基于獲得的數據對化合物定性定量，使用IBM SPSS Statistics 23 for windows（SPSS Corp.，Chicago，USA）和Microsoft Excel 2003軟件進行統計分析。結果表示為，P＜0.05，差異顯著，每組實驗平行3 次。

2 結果與分析

2.1 基于GC-MS技術對灘羊肌肉煮制過程中揮發性物質的變化規律分析

如表1所示，通過GC-MS對12 個灘羊肌肉樣本在煮制過程中的揮發性物質進行檢測，最終共檢測出42 種揮發性物質，其中醛類16 種、酮類6 種、醇類5 種、酸類3 種、雜環類化合物12 種。不同階段共檢測出14（50 ℃）、16（60 ℃）、15（70 ℃）、25（80 ℃）、26（90 ℃）、27（煮沸0 min）、32（煮沸20 min）、32（煮沸40 min）、35（煮沸60 min）、39（煮沸80 min）、39（煮沸100 min）、26（煮沸120 min）種揮發性物質。

由表1可知，灘羊肌肉在煮制過程中，在不同煮制溫度和不同煮制時間產生的可揮發性化合物不同。當溫度為50 ℃時，壬醛相對含量為26.27%，庚醛為10.01%，己醛為7.64%，2-丁酮為1.40%，吡咯為1.43%；溫度為60 ℃時，壬醛相對含量為23.43%，庚醛為11.68%，己醛為7.54%，2-丁酮為1.78%，吡咯為3.59%；煮沸0 min時，壬醛為14.54%，庚醛為2.34%，己醛為5.37%，2-丁酮為0.48%，吡咯為10.75%；煮沸20 min時，壬醛相對含量為12.46%，庚醛為1.26%，己醛為3.93%，2-丁酮為0.48%，吡咯為9.24%。

在整個煮制過程中，檢測出的醛類物質在種類和相對含量上都占有較大比例，主要有壬醛、己醛、苯甲醛等。這些醛類物質的含量均呈現先增加后減少的趨勢，含量減少是因為達到了醛類物質溶解所需要的條件，從而溶解在肉湯中[21]，(Z)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛和(E)-2-壬烯醛等醛類物質是煮制溫度達到一定條件才檢測到，預測其原因是達到了反應所需條件。產生大量醛類化合物是因為在風味形成的過程中，當美拉德反應生成含有羰基的戊糖和丁糖時，進一步發生Strecker降解反應也可產生醛類，如苯甲醛是苯丙氨酸的降解產物[22]。此外，Strecker反應也會形成某些醛類物質，如2-甲基丁醛來源于亮氨酸的Strecker反應[23]。

在肌肉煮制過程中產生的主要酮類物質有2-丁酮、1-辛烯-3-酮、2,3-辛二酮、2-十一酮。其中2-丁酮于50 ℃時被檢出，因其能溶于水，且當溫度到達一定值時溶解度會隨溫度的升高而降低，所以其含量呈先增后減又增的趨勢，煮沸120 min后未檢出。1-辛烯-3-酮也在50 ℃時檢出，含量呈波動增減。2,3-辛二酮在加熱70 ℃時被檢出，含量呈先增后減趨勢，可能是部分酮類溶于肉湯，也有部分揮發所致[24]。2-十一酮煮沸后被檢出，因其不溶于水，所以含量一直處于增長狀態。醇類揮發性物質集中產生于加熱90 ℃以后，且其含量均呈現不穩定變化狀態。主要有1-戊烯-3-醇、1-戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇和(E)-2-癸烯醇。其中1-辛烯-3-醇閾值較低，對羊肉風味的形成作用較大。灘羊肌肉產生的酸類揮發性物質含量較低，閾值較高對肉香氣貢獻較小，主要有(E)-3-壬烯酸、(E)-2-壬烯酸和4-乙基辛酸。可以看出，在整個煮制過程中，酮類、醇類和酸類物質含量與所占比例均較低。但部分酮、醇、酸類是形成雜環類化合物或其他風味物質的重要中間體[25]，并對其他風味化合物起到一定的協同作用。比如灘羊肌肉產生的丙醛，可作為前體物質產生中間體丙酮，從而產生風味物質2,3-戊二酮，這與王亞娜等[26]對大足黑山羊肉揮發性風味物質進行分析后得出的結果具有一致性。

隨著煮制溫度和時間的升高，檢出的雜環類化合物的種類和數量也增多。其中吡咯、2-甲基吡啶和二甲基三硫醚于50 ℃被檢出，且含量隨著煮制溫度和時間的

變化呈先增后減的趨勢，含量減少可能是在煮制過程中轉化為其他的可揮發性化合物。4-甲基-5-羥乙基噻唑、2-戊基呋喃、2-甲基-5-(甲硫基)呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪均于70～80 ℃時被檢出，含量基本呈先增后減的趨勢。2-甲基哌嗪、2-乙酰基噻唑、4-甲基-2-異丁基吡啶和二甲基二硫醚于煮沸后被檢出，含量均呈先增后減，且初始含量均高于其他化合物的初始含量。芐基甲基硫醚于煮沸80 min后被檢測出，推測為達到了該物質形成所需要的條件，且含量呈增長趨勢。

表1 灘羊肌肉煮制過程中揮發性化合物含量變化Table 1 Changes in volatile compounds contents during cooking of Tan sheep muscle μg/kg

基于以上分析可知，在肌肉煮制過程中，揮發性物質的種類總體呈增長趨勢，如(Z)-2-庚烯醛和(E)-十八烯醛等隨著加熱溫度的上升逐漸被檢出；但其含量呈先增長后下降的趨勢，如2-戊基呋喃，在80 ℃時檢測到的相對含量為7.40%，且含量逐漸上升，至煮沸60 min后，相對含量由9.60%下降到8.40%。由Varavinit等[27]研究可知，含量增長的主要原因是風味前體物質隨著煮制溫度升高而增加直到達到了風味物質產生所需條件而被分解氧化。而含量下降是風味前體物質已基本被反應和揮發性物質溶于肉湯中多種可能因素導致的。在整個煮制過程中，因只采用灘羊肌肉作為樣本，故美拉德反應及硫胺素降解反應為主要反應，但也不能排除有肌內脂肪如結構磷脂、甘油三酯等的存在，因不飽和脂質熔點較低，故在50～90 ℃時，醛類、酮類、醇類、酸類等，特別是以脂質氧化為主體被產生的醛類所占比例較大，但在煮沸后，2-甲基吡啶、吡咯和2-戊基呋喃等雜環類化合物占主要比例，與王瑞花[28]對紅燒肉風味物質的研究結果一致。

2.2 基于GC-O技術的灘羊肌肉煮制過程揮發性風味物質分析

灘羊肌肉在煮沸80 min和100 min后產生揮發性物質種類較多，對其進行GC-O分析。如表2所示，共有29 種風味物質的檢測率大于50%且OAV＞1，可作為灘羊肌肉揮發性成分的特征氣味物質。

由表2可知，在這些風味物質中OAV大于10的有呈青香的戊醛、可可香和麥芽香的2-甲基丁醛、蔬菜味的2-乙基己醛、果香的(E)-2-丁烯醛、果香味的(E)-2-辛烯醛、松香和青草味的(E)-2-癸烯醛、蘑菇味的1-辛烯-3-酮和1-戊烯-3-醇、肉香和堅果味的4-甲基-5-羥乙基噻唑、青香和肉香的2-戊基呋喃，它們對灘羊肌肉的整體風味具有較大貢獻。然而，有些化合物含量雖低，但其對灘羊肌肉整體的風味貢獻卻大，如(E)-2-十一烯醛、4-乙基辛酸、4-甲基-5-羥乙基噻唑、2-戊基呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪及芐基甲基硫醚等。詹萍[18]對不同產地的羊肉所產生的揮發性化合物進行檢測，得出上述化合物是不同產地羊肉共有化合物的結論，與本實驗結果一致。

表2 灘羊肌肉中揮發性風味物質信息Table 2 Information about the characteristic volatile flavor substances of Tan sheep muscle

2.3 灘羊肌肉煮制過程中揮發性風味物質的形成

由表1和表2可知，灘羊肌肉在煮制過程中產生的揮發性風味物質在不同溫度、不同時段均發生變化，也正是這些變化，使得灘羊肌肉整體風味更加飽滿。

在煮制過程中風味物質形成的主要途徑是美拉德反應以及與其相關的Strecker降解反應[29]。發生美拉德反應的前體物質有糖類、核苷酸、自由氨基酸、肽類等[30-31]。通過加熱使得只具有咸腥味，基本無香味的生鮮肉產生醛類、呋喃衍生物、酮類、吡嗪類等揮發性風味物質[21,32]。由表1可看出，在煮制前期，灘羊肌肉中產生醛類、酮類、醇類、酸類等主要揮發性風味物質的含量占有較大比例。為進一步研究肌內脂肪對灘羊肌肉風味的影響，取與煮制所用同批次灘羊肌肉進行脂肪酸提取后，采用GC-MS技術對灘羊肌肉中的脂肪酸進行檢測分析，結果如表3所示。

表3 灘羊肌內主要脂肪酸含量Table 3 Contents of main fatty acids in Tan sheep muscle

由表3可知，灘羊肌肉檢出的脂肪酸有棕櫚酸（40.35%）、硬脂酸（31.45%）、油酸（26.47%）、棕櫚油酸（1.16%）、亞油酸（0.59%）、亞麻酸（0.11%），未檢出肉豆蔻酸。羅玉龍等[33]檢測了蘇尼特羊和小尾寒羊中脂肪酸含量，得出棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和花生四烯酸為這兩種羊肉中的主要脂肪酸，且蘇尼特羊肉中棕櫚酸和硬脂酸含量高于小尾寒羊肉。由此可見，不同品種羊肉中所含脂肪酸含量也有所不同。在灘羊肌肉煮制過程中，由于肌內脂肪的存在，使得美拉德反應及硫胺素降解反應與脂肪發生交互反應，產生了醛類、酮類、醇類、酸類等揮發性風味物質。除此之外，美拉德反應和硫胺素降解反應也可產生。

醛類主要來源于脂肪的氧化降解，但Strecker降解反應也可產生醛類物質。Strecker降解是由氨基酸作為前體物質脫羧、脫氨后形成醛類。Varoujan等[34]研究表明：當美拉德反應產生戊糖和丁糖含羰基的降解產物如2,3-丁二酮和2-氧代丙醛等化合物時，可作為催化劑促進Strecker降解反應的發生，從而產生醛類。

酮類、醇類、酸類在灘羊肌肉中產生，一部分原因是肌內脂肪的存在，發生氧化降解反應產生酮類、醇類、酸類等揮發性風味化合物。另一部分原因是大多的支鏈醇來自氨基酸的Strecker降解，多數直鏈醇來自不飽和脂肪酸的氧化降解反應[35-36]。羅玉龍等[37]以蘇尼特羊肌肉為研究對象，檢測出醛類、醇類、酮類、酸類、烴類和其他化合物，同時還對肌內脂肪進行了研究，表明肌內不飽和脂肪酸的含量對風味產生起重要作用，與本研究結論一致。從而合理解釋了為何主要產自于脂肪氧化的醛、酮、醇、酸類風味化合物會在灘羊肌肉中產生的現象。

在整個煮制后期檢測出大量的雜環類化合物，其中具有肉香的二甲基二硫醚和硫香味的二甲基三硫醚因其具有獨特的化學元素而使得肉品的風味更加豐富。這是因為當肉被加熱，硫氨酸作為前體物質降解重排后生成噻唑、噻吩、呋喃及硫類等化合物[38-39]，且核糖與半胱氨酸作為前體物質也可以產生硫化物，并成為肉制品中重要的風味化合物。由表1和表2可看出，呈硫香味和洋蔥味的二甲基三硫醚及呈肉香味和洋蔥味的二甲基二硫醚相繼被檢出，且其OAV均大于1，說明其對灘羊肌肉的風味的呈現具有重要的作用。

3 結 論

本實驗以灘羊肌肉為研究對象，在50、60、70、80、90 ℃以及煮沸后0、20、40、60、80、100、120 min時采樣，通過GC-MS及GC-O技術對12 組樣品進行檢測分析，共檢測出42 種揮發性物質，即醛類（16 種）、酮類（6 種）、醇類（5 種）、酸類（3 種）和雜環化合物（12 種）。

研究表明，從灘羊肉中剔除脂肪后，由于肌肉組織中存在的少量脂質，在煮制前期，醛類、酮類、醇類等相對含量較大，如壬醛、苯甲醛等相對含量分別為26.27%和23.47%。但在煮制后期，這些物質便失去主導地位，低溫美拉德反應特別是硫胺素降解反應所產生的吡咯、吡啶、噻唑等雜環類化合物開始占據有利地位，如2-戊基呋喃和2,3,5,6-四甲基吡嗪相對含量分別為17.59%和9.90%。但因揮發性風味物質的含量與其風味閾值關聯性不大，對揮發性物質進行嗅聞技術檢測及OAV定量后，確定如(E)-2-十一烯醛、4-乙基辛酸、2-戊基呋喃、2,3,5,6-四甲基吡嗪、二甲基二硫醚和芐基甲基硫醚等揮發性風味化合物為灘羊肌肉的主要風味物質。

依據揮發性風味物質隨溫度變化其種類及含量的變化規律，結合加熱時美拉德反應和硫胺素降解的反應機理，本實驗進一步分析了灘羊肌肉風味物質由前體（硫胺素、氨基酸、糖等）形成風味物質的過程。研究灘羊肌肉煮制過程中不同階段所產生的可揮發性風味化合物，可為手抓羊肉、清燉羊肉等寧夏特色灘羊肉制品工業化加工風味控制提供理論參考。