臘肉拮抗菌分離及抗真菌脂肽特性分析

高兆建，秦宸鍇，黃亮浩，朱 雙，朱勁虎，趙宜峰

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000）

隨著全球對食品安全的日益重視，食品防腐劑作為一種食品工業中重要的添加劑逐漸得到廣泛關注。為防止食品腐敗變質延長貨架期，向加工食品中添加防腐劑是最常用的方法。食品防腐劑按來源分為化學合成防腐劑和天然防腐劑，其中化學防腐劑如亞硝酸鈉、苯甲酸鈉、苯甲酸等使用最多。然而，化學防腐劑存在潛在危害。發掘并使用天然無毒的抗菌劑是目前研究的熱點。近年來，抗菌脂肽作為一種天然抗菌物質，有望成為化學防腐劑的理想替代品。

芽孢桿菌屬菌株是一類分布廣泛并能在極端環境下生存的革蘭氏陽性細菌[1]，可以分泌多種抗菌活性的環狀脂肽。它們通過非核糖體基因編碼多酶復合催化合成，包括表面活性素[2]、伊枯草菌素（Iturin）[3]、芬芥素[4]和庫斯塔克素[5]4 大類。其中伊枯草菌素家族成員包括伊枯草菌素A、B、C、D、E，芽孢菌素D、F、L以及抗霉枯草菌素等，它們都是由7 個氨基酸殘基組成的一個肽環和連接一個C14～C17的β-氨基脂肪酸組成，其主要通過離子空隙進行滲透干擾。抑菌方面，對病原真菌的作用較強，對病原細菌及病毒的作用強度較弱[6]。抗菌脂肽具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒、抗支原體[7-8]等功能，并且抗菌譜廣、安全無毒、不易產生耐藥性、易被生物降解等特點，其在農業、食品、醫藥、化妝品、環保、畜牧業等領域備受關注[9]。目前，關于芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽理論和應用研究主要集中在植物病害的防治方面[10]，而有關抗菌脂肽用于食品防腐的報道較少，而且來源不同的菌株所分泌的抗菌脂肽也有較大差異[11]。

本實驗從傳統臘肉中分離產生廣譜抗菌物質的芽孢桿菌。通過酸沉淀、硅膠柱層析和反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等方法從發酵液分離純化抗菌物質，進一步通過傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）對分離得到的抗菌組分及成分進行分析鑒定，旨在為開發新型、安全、高效的食品防腐劑或抗菌藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與樣品

用于檢測抑菌活性的參考菌株部分購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，部分由徐州工程學院江蘇省重點建設實驗室保存。

產脂肽菌株分離自江蘇省徐州傳統農家自制臘肉樣品。取回的樣品臨時4 ℃冰箱保存后及時處理。

1.1.2 試劑

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本TaKaRa公司；PCR引物 南京金斯瑞生物技術有限公司；蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；標準品Iturin A美國Sigma公司。

1.1.3 培養基

菌株初篩培養基：營養肉湯瓊脂（nutrient broth medium，NB）培養基；抗菌譜檢測培養基：NB培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）；種子培養基及發酵培養基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，NH4NO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.2～7.5。以上培養基均經過121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

3k15型冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp 9700型PCR儀 美國應用生物系統公司；JS-680D型凝膠成像系統 上海培清科技有限公司；1260半制備HPLC儀、Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）HPLC半制備柱 美國安捷倫公司；Qexactive Orbitrap型高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher公司；CascadaTMAN型超純水系統 美國PALL公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 產脂肽菌株的分離篩選與抑菌活性測定

采用抑菌圈法初篩產生抗菌物質的細菌菌株，以金黃色葡萄球菌為指示菌株。產生抑菌圈的菌株進一步以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉為指示菌株進一步初篩。對以上3 種指示菌均有抑制作用的菌株挑選出液態發酵復篩。按照8%的接種量接種種子液至發酵培養基，37 ℃條件下180 r/min振蕩培養60 h。發酵液4 ℃、10 000 r/min離心10 min，獲得發酵上清液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，得到除菌后的發酵上清液。

通過瓊脂孔擴散法[12]測定抑菌活性，制備對應不同指示菌的瓊脂培養基平板，將活化好的各指示菌活菌數（霉菌為孢子）調整到2.0×106CFU/mL并在平板上涂布150 μL，表面晾干后在培養基上打孔。將100 μL過濾除菌后的發酵液上清注入到不同指示菌對應的培養基平板孔中，指示菌在最適作用溫度下培養1～5 d，檢查平板抑菌圈情況，測定抑菌圈直徑大小，并以直徑大小表示抗菌活性高低。

1.3.2 拮抗菌株分類鑒定

形態學觀察：復篩獲得的優質菌株在NB固態培養基上37 ℃培養48 h，觀察菌落形態并革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形狀、排列方式等形態特征。

16S rDNA的擴增與序列分析：提取分離菌株總DNA，16S rDNA序列PCR擴增。擴增引物[12]如下：上游引物（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環；最后72 ℃延伸7 min。擴增序列測序結果運用BLAST軟件進行序列比對，選擇相似度較高的菌株序列，用ClustalX1.83與MEGA5.1軟件，采用Neighbor-joining法構建系統發育樹[13]。

1.3.3 菌體生長動力學及脂肽合成

將活化過的分離篩選到的菌株按照1%（V/V）接種量接種到發酵液體培養基中，培養溫度為37 ℃，培養72 h，每隔6 h取樣測定其600 nm波長處吸光度及抑菌圈直徑，以金黃色葡萄球菌為指示菌株[14]。

1.3.4 脂肽分離與鑒定

1.3.4.1 脂肽酸沉淀分離

鹽酸沉淀法提取抗菌活性物質[15]。發酵60 h后的發酵液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾除菌。用6 mol/L鹽酸調pH值至2.0，4 ℃靜置過夜后10 000 r/min、4 ℃離心15 min。沉淀部分甲醇抽提5 次，合并抽提液，凍干后用0.02 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解，得脂肽粗提物。

1.3.4.2 脂肽硅膠柱純化

粗提物用硅膠柱層析分段分離[16]，色譜柱為77 mm×93 mm硅膠柱，上樣后依次用二氯甲烷-甲醇體積比100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和0∶100梯度洗脫，每個梯度沖3～4 個柱體積。減壓快速洗脫后，收集各洗脫液于40～45 ℃減壓旋蒸去除溶劑，并對各組分抑菌活性檢測。

1.3.4.3 RP-HPLC純化

采用RP-HPLC分離經硅膠柱純化的抗菌活性強的組分[17]。流動相A為含0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為含0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流速為1 mL/min。上樣前用流動相A平衡3 個柱體積，上樣，再用流動相B線性梯度洗脫，45 min內從0%增加到90%，214 nm波長吸光度檢測，柱溫25 ℃。收集抗菌活性峰，合并后凍干備用。

1.3.5 FTIR掃描

把經過純化的脂肽用KBr壓片法測紅外吸收光譜[15]。光譜范圍4 000～350 cm-1；分辨率4 cm-1，掃描累加次數16 次。

1.3.6 脂肽質譜分析鑒定

采用MALDI-TOF-MS對純化的活性組分進行脂肽類型初步確定[18]。應用MALDI-TOF-MS技術及Data Explorer軟件準確分析其分子質量。分析條件為：基質DHB，激光束強度5 500，電壓1 560 kV，檢測范圍700～1 600 Da。

1.3.7 脂肽抑菌穩定性測定

脂肽酸堿穩定性[19]：部分純化的脂肽用HCl和NaOH分別調節其pH值為2、4、6、8、10和12，以蒸餾水為對照，于37 ℃作用12 h，然后將pH值調至7.0，金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測試不同pH值下抗菌脂肽的抑菌活性。

脂肽熱穩定性[19]：部分純化的脂肽溶液分別在25、40、60、80、100 ℃處理30 min，121 ℃處理20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂孔擴散法測試處理后的脂肽殘留抗菌活性。

蛋白酶敏感性[19]：部分純化的脂肽溶液分別添加終質量濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶，緩沖溶液調節各酶反應體系至各酶最適作用pH值，于37 ℃孵育2 h，然后80 ℃處理15 min滅活各酶活性。瓊脂孔擴散法測定對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。以去離子水代替蛋白酶作為空白對照。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 產脂肽菌株分離篩選與鑒定

傳統臘肉切碎后，經生理鹽水浸泡，富集培養后，梯度稀釋涂布于初篩平板上，共分離得到具有抗菌活性的菌株12 株。通過菌落形態和細胞形態分析，初步確定從培養基上分離到的微生物主要是細菌、酵母菌和放線菌。瓊脂孔擴散法檢測初步篩選出的菌株發酵液對不同細菌和真菌的抑菌效果，其中一株細菌XLP27對多種指示菌有廣譜抑菌活性，結果如圖1所示，其發酵液對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌）、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）及酵母菌（釀酒酵母）均有顯著抑菌活性，檢測平板上顯示清晰透明的抑菌圈。霉菌檢測顯示，對米曲霉、尖孢鐮刀菌、黑曲霉及短密青霉亦有明顯抑制作用，靠近1號樣品孔一側菌絲生長受到明顯抑制，而空白對照一側菌絲生長完全無影響。表明菌株XLP27發酵液中抗菌物質對細菌和真菌均有顯著抑制作用，故將其作為深入研究出發菌株。在牛肉膏蛋白胨培養基上37 ℃劃線培養24 h，菌株菌落呈圓形，表面光滑濕潤，乳白色，不透明，邊緣整齊，質地中等。革蘭氏染色鏡檢，菌體桿狀呈紫紅色，為革蘭氏陽性菌。菌株XLP27生理生化實驗的結果見表1。根據形態學及生理生化特性比較，參考文獻[21]，菌株初步鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

圖1 菌株XLP27無菌發酵液的抑菌作用Fig. 1 Antifungal and antibacterial activities of lipopeptide from strain XLP27

表1 菌株XLP27形態及生理生化特征Table 1 Morphological and biochemical characteristics of strain XLP27

將菌株XLP27的16S rDNA序列進行BLAST比對分析發現與GenBank數據庫中公布的B. pumilus不同菌株16S rDNA序列的相似度高達99%，系統進化樹分析結果見圖2，分離菌株XLP27與短小芽孢桿菌（登錄號：NR074977.1）親緣關系最近，結合菌株XLP27的形態學特征和生理生化特性，可再次確定菌株XLP27為B. pumilus。芽孢桿菌屬菌株因其可產生廣泛的有益代謝產物如抗菌物質和酶，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，如今已經成為發酵工業領域最為常用的菌株之一，特別是已經證明芽孢桿菌屬[22]中的很多不同種株可以產生對食源性腐敗菌及致病菌等細菌和真菌有抑制作用的抗菌物質，如B. amyloliquefaciensPPCB004[23]和B. velenzensisS3-1[24]可產生伊枯菌素；B. licheniformisstrain P40[25]和B. subtilisSN7[26]可產生細菌素類抗菌物質；B.amyloliquefaciensfiply 3A[27]可產生抗癌細胞的脂肽類桿菌霉素D。目前為止，以往B. pumilus脂肽文獻的報道主要涉及脂肽的表面活性功能，而對其抗菌特性并未見細致研究，如Fooladi等[28]分離了一株來自伊朗油田的B. pumilus2IR菌株，并對該菌株產生的表面活性特性脂肽做了發酵條件優化和表面活性特性研究；Slivinski等[29]報道了B. pumilusUFPEDA 448固態發酵法生產表面活性素脂肽。本研究是首次從臘肉中分離到產脂肽的B. pumilus菌株。

圖2 基于16S rDNA序列構建的菌株XLP27的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain XLP27 based on 16S rDNA gene sequence

2.2 B. pumilus XLP27生長動力學及脂肽合成

圖3 B. pumilus XLP27生長動力學及脂肽合成Fig. 3 Growth kinetic curve of B. pumilus strain XLP27 and lipopeptide production as a function of culture time

如圖3所示，0～2 h處于生長延遲期；2～8 h時，吸光度快速升高，處于對數生長期；8～26 h吸光度繼續增加但是緩慢，處于對數生長期的后期；26～60 h吸光度基本恒定，菌體處于穩定期；60 h后吸光度出現下降趨勢，表明菌體開始進入衰亡區。14 h開始出現抑菌圈，直徑為6 mm，表明脂肽從對數期的后期開始合成；14～48 h內，抑菌圈直徑不斷變大，此時脂肽抗菌活性不斷提高；60 h后抑菌圈直徑大小基本不變，表明脂肽抗菌活性達到最大穩定值，且最大直徑為26 mm。對照菌體濃度增長曲線，脂肽合成在指數期的末期開始，主要合成在穩定期，由此判斷該菌株合成的抗菌脂肽屬于次級代謝產物，且最佳培養時間為60 h。這與Fannei等[14]報道莫海威芽孢桿菌曲線基本一致，10 h即開始合成脂肽，20 h后產量不斷增加；馮濤等[30]報道的納豆芽孢桿菌生長曲線呈“S”形，在11 h開始合成脂肽，50 h后基本保持穩定；Lee等[19]報道的芽孢桿菌LM7穩定期開始合成脂肽，主要在發酵34～50 h合成，以后發酵產量基本恒定；黃翔峰等[31]研究發現不同的發酵條件也會引起合成脂肽時間變化。

2.3 B. pumilus XLP27脂肽純化

菌株XLP27發酵液經酸沉淀和快速硅膠柱層析后得到5 個組分，分別對每個組分檢測抗菌活性，顯示一個組分對尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用，該組分進一步通過RPHPLC分離，色譜層析如圖4所示。在保留時間0～45 min內洗脫得到多個大的洗脫峰和很多小峰，說明HPLC柱效優良，分離效果顯著，可將不同成分分開。洗脫40 min后，沒有出現額外的峰，表明所有化合物都被從柱中洗脫出。對每個主洗脫峰檢測抗菌活性，在出峰時間19.2 min的洗脫峰即P3峰具有明顯的抑菌活性，靠近樣品孔一側的菌絲受到抑制不能延伸生長，而其他收集峰樣品對菌絲生長無影響（圖5）。將P3出峰保留時間同標準樣品Ituri（19.76 min）對比，顯示兩者保留時間相接近，推測P3抗菌物質為Ituri類脂肽。RP-HPLC能夠有效將雜質同脂肽分離，進一步說明前期脂肽酸沉淀、硅膠柱分段分離雖不能分離出單一成分的脂肽，但能去除影響RP-HPLC分離的大量雜質，為RP-HPLC發揮良好的分離效果奠定基礎。國內外已報道了不同來源脂肽的分離純化，Nanjundan等[12]通過微型切勢流過濾、酸沉淀、RP-HPLC實現了表面活性素類脂肽的純化；Arroyave-Toro等[32]通過樹脂球吸附、C18固相萃取和RPHPLC純化了對采收后果蔬致病真菌有抑制作用的脂肽；Lee等[19]用硫酸銨鹽析和熱處理方法對從韓國傳統發酵豆中分離的Bacillussp. LM7脂肽進行純化。與報道相比，本研究的脂肽純化方法步驟簡單、分離效果好，可作為脂肽純化的借鑒。

圖4 B. pumilusXLP27脂肽RP-HPLC分離Fig. 4 RP-HPLC profile of antibiotics produced by B. pumilus XLP27 detected at 220 nm

圖5 RP-HPLC分離各洗脫峰對尖孢鐮刀菌抑菌作用Fig.5 Antifungal activity of elution peaks of lipopeptide from RP-HPLC against Fusarium oxysporum

2.4 純化脂肽FTIR分析

圖6 B. pumilus XLP27脂肽FTIR分析Fig. 6 FTIR spectrum of lipopeptide from B. pumilus XLP27

經RP-HPLC純化的樣品FTIR分析結果見圖6，3 292.36 cm-1是由分子間氫鍵引起的NH收縮振動譜帶；3 081.09 cm-1是由NH基團的分子內部氫鍵引起的NH收縮振動譜帶；1 661.77、1 542.67 cm-1分別為酰胺譜帶I和II，上述的吸收特征表明，該表面活性劑分子的親水基為一肽鏈。2 954.90～2 852.81 cm-1和1 461.85～1 719.91 cm-1的2 處吸收為脂肪族碳鏈的CH伸縮振動，1 719.91、1 217.97 cm-1為2 處內酯鏈的特征吸收，表明樣品含有脂肪酸分子。綜合以上特征，并參照文獻報道的脂肽類抗菌物質FTIR數據[15,33]，推測純化的抗菌物質為環脂肽類。

2.5 抗菌脂肽MALDI-TOF-MS分析

經過RP-HPLC分離的活性組分MALDI-TOF-MS質譜分析，圖7顯示，有1 個m/z離子簇出現，該離子簇色譜峰包含5 個分子離子峰，其分子質量分別為1 046.182、1 060.213、1 074.198、1 088.201、1 102.175，推測由5 種不同脂肪酸鏈的同系物組成，并且分子質量依次相差14 Da，恰好與脂肪酸鏈長度C14～C18的Iturin A分子質量相對應，推測為Iturin A，這與文獻報道的Iturin A質譜分析數據基本一致，Rodríguez-Chávez等[15]報道的B. subtilisQ11脂肽MALDI-TOF-MS檢測到m/z分別為1 046.48、1 060.558、1 074.58和1 088.51四個離子峰，對應脂肪鏈長度為14、15、16、17 個—CH2—長度的Iturn A同系物；El Arbi等[34]研究的抗真菌脂肽混合物中Iturin MALDI-TOF-MS檢測到m/z為1 106.7、1 122.7、1 134.8和1 150.8的4 個離子峰。

圖7 B. pumilusXLP27脂肽類物質MALDI-TOF-MS分析Fig. 7 MALDI-TOF mass spectrum of lipopeptide from B. pumilus XLP27

2.6 B. pumilusXLP27脂肽抗菌譜

表2 B. pumilus XLP27脂肽對不同指示菌的拮抗作用Table 2 Antifungal and antibacterial activities of lipopeptide from B. pumilus strain XLP27

部分純化的脂肽抑菌譜如表2所示，脂肽對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細胞性李斯特菌都有較強的抑菌活性；對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、福氏志賀氏菌、傷寒沙門氏菌也有較好的抑菌作用，對銅綠假單胞菌抑菌作用稍弱。脂肽對酵母菌如釀酒酵母和白色念珠菌有稍弱的抑菌活性，但對霉菌黑曲霉、米曲霉、尖孢鐮刀菌和短密青霉抑菌作用較強。整體看出，脂肽有廣譜抑菌活性，特備是對革蘭氏陽性細菌和霉菌有強烈的抑菌作用。近年有很多芽孢桿菌脂肽的報道，但不同菌株脂肽特性往往不同，Cao Yun等[20]分離出的枯草桿菌SQR抗菌脂肽、Arroyave-Toro等[32]發現的B. subtilisEA-CB0015脂肽以及Nanjundan等[12]從濕地土壤中分離出的B. amyloliquefaciensSR1抗菌脂肽均對多種植物病源具有良好的抑制作用，但均未見其對細菌的抑菌報道；Zheng Dehong等[17]發現的B. thuringiensisBMB171除了能產生對致病菌有良好的抑制作用的脂肽外，還可以產生拮抗線蟲的抗菌物質；Balan等[18]分離的Aneurinibacillus aneurinilyticusSBP-11對多種病源細菌有良好的抑菌作用，而未見對真菌的抑菌性能報道。本研究的B. pumilusXLP27脂肽不僅對細菌表現良好的抑菌特性，對所試的多種絲狀真菌也有顯著的抑菌效果。針對脂肽Iturin對真菌的抑菌作用機理，據研究，Iturin與真菌細胞膜的主要成分麥角甾醇相互作用，產生Iturin-磷脂或Iturin-磷脂-甾醇聚集復合物，從而使細胞膜的形狀改變，導致在脂質雙層膜中形成大的離子通道，使K＋被釋放出來[15]。脂肽對細菌的抑菌作用機理，研究認為脂肽錨定到細胞表面，導致細胞膜形成孔洞；由此電子傳遞鏈超活化、氧化磷酸化解偶聯，致使形成大量超氧陰離子自由基，這些自由基使細胞膜中的脂類過氧化，由此增加了細胞膜的滲透性，導致胞內蛋白滲漏，最終細胞死亡[18]。接下來將通過掃描電鏡觀察細胞表面情況，探索脂肽對真菌和細菌的抑菌機理。

2.7 B. pumilus XLP27脂肽穩定性

熱穩定性是評價脂肽能否應用生產的一個重要指標，在食品、飼料加工工藝中，都會涉及加熱處理。如圖8所示，脂肽經25～80 ℃處理后其抑菌活性基本無變化，穩定性保持在95%以上；在100 ℃下加熱后，其抑菌活性也保持在80%左右；當在121 ℃條件下加熱20 min（高溫高壓滅菌)，抑菌活性顯著降低，但沒有完全喪失抑菌活性，扔具有43%的抑菌活力。整體說明脂肽熱穩定性好。Lee等[19]報道的Bacillussp. LM7脂肽Anti-LM7也具有相似的耐高溫特性。在食品工業中，使用單一的抗菌物質很難確保食品不會腐敗變質，通常將單一的抗菌物質和其他類型的抗菌劑或者除菌技術如加熱、輻射、脈沖電場等聯合使用，以確保食品在保藏期內不會腐敗變質[19]。本研究的脂肽高溫耐受性好，能夠承受食品加工工藝中的高溫處理，故有潛力作為天然食品防腐劑在食品中使用。

圖8 溫度對B. pumilus XLP27脂肽抑菌活性的影響Fig. 8 Effect of temperature on the antibacterial activity of lipopeptide from B. pumilus XLP27

圖9 pH值對B. pumilus XLP27脂肽抑菌活性的影響Fig. 9 Effect of pH on the antibacterial activity of lipopeptide from B. pumilus XLP27

由圖9可知，在pH 4.0～10之間脂肽穩定性最佳，抑菌活性均保持90%以上，在pH 2.0及pH 12時其抑菌活性略低，但抑菌活性仍然保持65%及52%。由此看出，本研究脂肽在弱酸、弱堿及中性條件下均具有良好的穩定性，這與多黏類芽孢桿菌脂肽[35]穩定性相似，其在中性條件下比較穩定，強酸性和強堿性條件下不穩定；Lee等[19]報道的Bacillussp. LM7脂肽Anti-LM7在pH 4～9范圍內穩定，pH 3.0或11.0時約損失50%的抑菌活性。國內外文獻報道具有酸堿穩定性的抗菌脂肽大多為表面活素類脂肽，雖然也有良好的酸堿穩定性，但以脂肽表面延展性為指標，以抗菌性能為指標的鮮見報道。脂肽良好的酸堿穩定性使其可以在不同類型的食品中作為天然防腐劑廣泛應用。

圖10 不同蛋白酶對B. pumilus XLP27脂肽的作用Fig. 10 Resistance to different proteases of lipopeptide from B. pumilus XLP27

如圖10所示，與空白對照相比，蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶幾乎對脂肽活性無任何影響，進一步證明本研究分離純化到的抗菌物質為脂肽類，而不是容易受到蛋白酶降解而完全失活的細菌素類。胰凝乳蛋白酶有輕微的抑制作用，推測構成脂肽的環狀多肽鏈中含有胰凝乳蛋白酶所識別的氨基酸基團。據研究，胰凝乳蛋白酶可以水解酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的羧基側肽酰胺鍵，脂肽中可能存在這幾種氨基酸中的一種或幾種[19]。脂肽對蛋白酶的低敏感性與報道的多數脂肽一致[36]，研究認為脂肽之所以對各種蛋白酶不敏感主要是因為在脂肽環狀肽鏈中廣泛存在非正常的氨基酸如D型氨基酸，由此導致脂肽對肽鏈內切蛋白酶有強的抵抗性[37]。由此說明本研究脂肽可以不受消化道中蛋白酶的影響而穩定存在，可以作為飼料添加劑使用。

3 結 論

從傳統臘肉中分離篩選得到1 株產脂肽的B. pumilusXLP27。該菌株脂肽目前研究主要涉及表面活性劑特性，針對B. pumilus脂肽抗菌特性的研究鮮見報道。B. pumilusXLP27脂肽主要在穩定期合成。通過酸沉淀、硅膠柱層析及RP-HPLC純化得到單一組分抗菌物質。FTIR及MALDI-TOF-MS鑒定抗菌物質為環狀脂肽Iturin A。該脂肽具有廣譜抗菌特性，對G＋、G-細菌有良好的抑菌作用，對絲狀真菌及酵母菌也顯示優良的抑制特性。脂肽在100 ℃的高溫及廣泛的pH值范圍內穩定性良好。鑒于以上特性，B. pumilusXLP27所產脂肽有潛力在植物病源真菌生物防治、飼料添加劑，特別是在新型天然食品防腐劑方面開發應用。