產低溫蛋白酶動性球菌的篩選及其在低鹽魚露發酵中的應用

周 晶，袁 麗，高瑞昌

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

魚露是一種很受歡迎的傳統發酵調味品，有獨特的風味和口感。傳統魚露的生產通常以低值魚蝦為原料，混入質量分數30%的食鹽，在魚體自身的酶和嗜鹽微生物的共同作用下，發酵數月制得[1]。鹽添加量、溫度、添加酶或產酶微生物等工藝是影響魚露風味的主要因素，因此，為了縮短生產周期，保溫發酵、外加酶發酵和外加曲發酵等技術陸續被開發出來[2]，但魚露產品仍然存在高鹽的弊端。眾周所知，高鹽給人體健康帶來巨大的危害[3]，因此對低鹽魚露的開發成為研究方向。低鹽發酵會產生原料腐敗[4]，采用低溫發酵則會降低腐敗，但是低溫條件下微生物和酶的活性又受到抑制，同樣會延長生產周期。因此，在發酵過程中尋找加鹽量和發酵溫度的平衡，是實現低鹽魚露生產的重要問題。理想的起始發酵劑應該具備在低溫條件下能夠生長并且產生的胞外蛋白酶具有較高酶活力的特性。

溫度是影響發酵過程中微生物的生長和酶的產生的重要參數之一。嗜冷菌通過產生冷適應酶生存，這種酶具有應對低溫引起化學反應速率降低所需的特性[5]。低溫蛋白酶通常是指最適催化溫度在40 ℃及以下的一類蛋白水解酶[6]。在中低溫條件下，嗜冷酶有更高的活性，并且與嗜中溫酶相比，嗜冷酶能夠在較低的溫度下被滅活[7]。這些性能對于工業應用非常有益。目前，應用在食品工業中的蛋白酶大多屬于中高溫蛋白酶，溫度范圍是50～75 ℃[8-10]。在過去幾年，許多學者已經分離出大量產冷適應酶的微生物并進一步研究，例如來自冰川土壤的地衣芽孢桿菌[11]、來自北極海冰的科威利亞菌[12]以及來自南極的梭狀芽孢桿菌屬[13]等。目前，冷適應蛋白酶在冷水洗滌、生物降解以及低溫脫毛等工業過程中應用廣泛，然而將冷適應蛋白酶應用于食品發酵中卻鮮見報道。利用產冷活性蛋白酶微生物作為發酵劑縮短魚露發酵周期，同時改善風味的研究還鮮見報道，尤其是利用動性球菌屬（Planococcus）。因此，本研究從傳統蝦醬中篩選并鑒定4 株動性球菌，進而探索其作為起始發酵劑應用與低鹽魚露生產的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統發酵蝦醬為山東榮成市農家自制；細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）由北京諾賽基因組研究中心有限公司提供；LB液體培養基、液體Gibbons培養基、牛奶平板、固體Gibbons培養基（干酪素、酵母提取物、胰蛋白胨、脫脂乳粉、檸檬酸三鈉、氯化鉀、七水硫酸鎂、氯化鈉、福林-酚、三氯乙酸、碳酸鈉） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型單人單面超凈臺 上海蘇凈實業有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；LRH-250生化培養箱 上海一恒科技有限公司；UV1601紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg離心機 德國艾本德股份公司；HBA-1151聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 MJ Research公司；Alphalmager數字通用型凝膠成像分析系統 美國Alapha Innotech公司；恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；HZQ-2全溫振蕩器 江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產低溫蛋白酶菌株的篩選及鑒定

1.3.1.1 菌株富集和篩選

為了富集蛋白酶生產菌株，將1 g傳統蝦醬接種于99 mL的液體Gibbons培養基中。接種的三角燒瓶在25 ℃、150 r/min的旋轉搖瓶培養箱中培養2 d。將接種培養的一系列稀釋液（10-2～10-6）涂于含1%脫脂乳粉Gibbons瓊脂平板表面，15 ℃培養2 d。通過觀察菌落周圍形成一個清晰透明的區域，檢測到產蛋白酶菌株，然后，挑取該菌落進行劃線純種培養并對菌種進行保藏。

1.3.1.2 菌株鑒定

采用加熱的方法提取菌體基因組DNA并作為擴增模板。使用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對16S rRNA進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并進行紫外照射。將細菌16S rRNA基因克隆到T載體并委托北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。使用EzBiocloud數據庫對序列進行比對，并采用MEGA 6.0版構建系統發育樹。

1.3.2 菌株生長特性

活化菌株并按照2%的接種量接種于Gibbons液體培養基中，在不同溫度條件下測定菌懸液在660 nm波長處的OD值，表示動性球菌的生長情況。溫度梯度設置為5、15、25、35 ℃和45 ℃，pH值梯度設置為4、6、7、8和10，NaCl質量分數梯度設置為0%、5%、10%、15%和25%，培養48 h后測定OD值。

1.3.3 酶學特性

4 株菌的接種量均為1%，培養48 h后，取相同體積的培養液以10 000 r/min、4 ℃離心20 min，將離心得到的沉淀加入相同體積的蒸餾水重懸后用超聲進行破碎，即為粗酶液，并將粗酶液保存于4 ℃。蛋白酶活力的測定采用福林-酚法[14]，先將10.0 g/L酪蛋白溶液和粗酶液分別放入40 ℃恒溫水浴中，預熱5 min。將1.0 mL酪蛋白溶液和1.0 mL粗酶液加入試管中并充分混勻，然后在40 ℃處理10 min。溫育結束時，取2.0 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）加入試管并混合。混合物4 ℃、10 000 r/min離心5 min。將1.0 mL上清液轉移至新的試管中，加入5.0 mL碳酸鈉溶液和1.0 mL福林-酚試劑。充分混合后在40 ℃水浴中顯色反應20 min。最后，在680 nm波長下測定溶液的吸光度。在其他條件不變的情況下，將TCA滅活的酶液作為空白組。

為測定不同溫度條件對蛋白酶活力的影響，分別在20、30、40、50、60、70 ℃進行酶促反應10 min，測定蛋白酶活力。配制pH值為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的緩沖液，用緩沖液配制質量分數為1%的酪蛋白溶液作為底物，將酶液與一系列底物在40 ℃保溫，通過測定酶活力，得到酶反應的最適pH值及pH值對酶活力的影響。在最佳pH值和溫度條件下，以0、3、6、9、12、15 g/100 mL為NaCl質量濃度梯度，測定其對蛋白酶活力的影響。

1.3.4 低鹽魚露樣品的制備

從傳統發酵的蝦醬（山東威海，冬季采集）中分離得到了4 株動性球菌，分別命名為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。這4 株動性球菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），編號分別為CGMCC NO.17057、CGMCC NO.17058、CGMCC NO.17059和CGMCC NO.17060。以斑點叉尾鮰碎肉為原料進行魚露發酵。先添加0.5%中性蛋白酶（Macklin，上海）對鮰魚碎肉進行預水解（55 ℃，2 h），再加入1%木瓜蛋白酶（SCRS，上海）孵育3 h（45 ℃）。隨后將樣品冷卻至室溫，加入8%海鹽和3 mL/100 g的混合發酵劑（4 株動性球菌的接種比例為1∶1∶1∶1），得到細胞密度約為106～107CFU/mL。在相同條件下，不添加發酵劑制備對照品。所有處理在21 ℃孵育15 d。添加混合發酵劑的魚露樣品記為A組，未添加混合發酵劑的樣品記為B組，原料碎魚肉記為C組。

1.3.5 氨基酸態氮（amino acid nitrogen，AAN）和總揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）分析

AAN的測定采用比色法[15]。吸取2 mL魚露樣品于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4 mL顯色劑（甲醛和乙酰丙酮的混合溶液），用水稀釋至刻度，混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后，移入比色皿內，于波長400 nm處測量吸光度。TVB-N的測定參照GB 5009.44—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的微量擴散法[16]。

1.3.6 揮發性風味物質的測定

魚露中的揮發性風味物質通過固相微萃取-氣相色譜-質譜法進行檢測鑒定[17]。將5 mL液體魚露樣品轉移到20 mL樣品瓶中并用硅膠墊密封。樣品在60 ℃水浴中加熱30 min，以獲得頂空平衡。使用石英纖維（DVD/CAR/PDMS，50/30 μm，Supelco，Bellefonte，Pa，U.S.A.）吸收頂部空間的揮發性化合物。將纖維引入氣相色譜-質譜聯用儀的進樣口，250 ℃解吸5 min。氣相色譜-質譜分析采用初始溫度為40 ℃并保持4 min，然后以5 ℃/min速度增加到120 ℃并保持5 min，以15 ℃/min的速度增加到230 ℃并保持10 min。He作為載氣，流速為0.8 mL/min。本實驗測定3 種樣品中的揮發性化合物的相對含量。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌株的篩選和鑒定

圖1 菌株在牛奶平板上產生的水解透明圈（A、B）及菌株的革蘭氏染色分析Fig. 1 Hydrolytic transparent circles produced by the isolates on agar plates with skim milk (A, B) and Gram-staining analysis

通過在添加脫脂乳粉瓊脂平板上觀察水解透明圈的方法，成功從傳統發酵蝦醬中篩選并分離出4 株有較高蛋白酶活力的細菌。因為在細菌菌落周圍產生了清晰的水解圈（圖1），這4 株菌被鑒定為蛋白酶產生菌即XJ2、XJ10、XJ11和XJ12。在蛋白酶活力檢測中，與其他菌株相比，XJ11有最高的蛋白酶活力（（10.07±0.11）U/mL，P＜0.05，表1）。革蘭氏染色分析表明，4 株菌均為革蘭氏陽性球菌，與張曉燕等[18]分離的沙雷氏菌有所不同，產低溫蛋白酶的沙雷氏菌為革蘭氏陰性菌。

表1 4 株菌的酶活力分析Table 1 Enzymatic activity analysis of four selected strains

使用序列分析軟件MEGA進行核酸序列比對，進一步構建系統發育樹。在16S rRNA基因分析的基礎上，利用BLAST搜索技術對4 株菌序列進行系統描述和親緣關系鑒定。系統發育樹分析表明，菌株XJ2、XJ10、XJ11和XJ12分別落在P. maritimusCP016538菌群、P. plakortidisCP016539菌群、P. dechangensisJQ762282菌群以及P. rifietoensisCP013659菌群中（圖2）。因此，將這4 株菌分別命名為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。

2.2 菌株的生長特性

圖3 動性球菌的生長特性Fig. 3 Growth characteristics of Planococcus

在不同的培養溫度下探究液體培養基中動性球菌的生長特性。4 株動性球菌均能在5～45 ℃的溫度下生長，且在25 ℃時有最大生長值（圖3a），這與沙雷氏菌A29-2有相同的溫度生長特性[18]。在極端溫度下（5 ℃和45 ℃），菌株生長非常緩慢。由圖3a可知，當溫度為5～25 ℃時，細胞密度隨溫度的增加呈現升高的趨勢；當溫度高于25 ℃時，細胞密度有下降的趨勢。當溫度為15 ℃時，菌株有最快的生長速率，這也就表明動性球菌能在低溫條件下較快生長。環境中的pH值變化會對細菌的生長產生重要的影響，主要是影響細菌對營養物質的解離與吸收。圖3b顯示，當初始pH值為7～8時，測得的細胞密度最高，因此動性球菌為中性偏堿性細菌。當NaCl質量分數大于15%時菌株幾乎不生長；當NaCl質量分數為0%～15%時，細胞密度隨NaCl質量分數的增加而降低（圖3c）。基于此，本實驗認為動性球菌不屬于嗜鹽菌，但具有一定的耐鹽性。在最優的生長條件下，測得動性球菌的生長曲線（圖3d）。16～48 h為動性球菌的指數生長期，即細胞密度快速增長的階段，了解生長曲線有助于準確掌握接種時間，從而加快發酵速率。

2.3 粗蛋白酶酶學特性

圖4 溫度（a）、pH值（b）和NaCl質量濃度（c）對蛋白酶酶活力的影響Fig. 4 Effect of temperature (a), pH (b) and NaCl concentration (c) on protease activity of the four strains

溫度、pH值和NaCl質量濃度對產酶的影響較大。在優化溫度的實驗中，動性球菌所產的粗酶在10～60 ℃的溫度范圍內有活性，在40 ℃時檢測到蛋白酶的最大活性（圖4a）。與南極嗜冷桿菌Ta41的蛋白酶S41（-2～4 ℃）[19]和嗜鹽古生菌Halogranum rubrum的耐鹽蛋白酶（50 ℃）[20]相比，動性球菌的蛋白酶具有更好的冷適應能力。在不同緩沖體系pH 3.0～11.0范圍內，測定了pH值對蛋白酶活性的影響。結果（圖4b）表明，該蛋白酶在7.0～11.0的較寬pH值范圍內具有活性。pH值為9.0時，動性球菌XJ2、XJ10和XJ12所產的蛋白酶活性最高，說明所產的酶是一種堿性蛋白酶，這與來自其他微生物的堿性蛋白酶也有相同的pH值范圍[21]。如圖4c所示，蛋白酶在NaCl質量濃度為0～15 g/100 mL時有活性，在15 g/100 mL時活性最低。盡管蛋白酶在高鹽濃度下有所降低，但當NaCl質量濃度為1～9 g/100 mL時仍有較高的酶活力，因此該蛋白酶在一定程度上具有耐鹽性。

2.4 AAN和TVB-N含量

AAN是發酵產品最重要的質量指標之一。在魚露發酵過程中，AAN的存在可歸因于蛋白酶的活性。本研究中發酵魚露中AAN含量在發酵過程中呈現增加的趨勢，這結果與之前的報道相同[21-22]。在發酵的最后階段（15 d，圖5），A組中的AAN質量濃度（1.33±0.08）g/100 mL明顯高于B組（（0.89±0.02）g/100mL，P＜0.01）。有報道指出，發酵2 a的傳統魚露的AAN質量濃度可達到（1.10±0.03） g/100 mL[23]。在降低溫度和NaCl質量分數的同時仍然能夠保證魚露的質量，這主要歸功于采用動性球菌作為起始發酵劑。與發酵劑Staphylococcussp. CMC5-3-1相比[24]，本實驗的發酵時間從180 d降低至15 d，加鹽量從25%降低至8%。根據以上的AAN結果，可以得知在發酵過程中添加動性球菌發酵劑能夠有效增加魚露中AAN含量。TVB-N是反映魚露腐壞程度的主要指標，隨發酵時間的延長，2 組樣品的TVB-N值均呈現上升的趨勢[25]。發酵15 d后，B組TVB-N質量濃度達到（209.00±1.49）mg/100 mL，然而A組TVB-N質量濃度（170.00±1.05）mg/100 mL明顯低于B組（P＜0.05）。結果表明，發酵劑（動性球菌）可以抑制腐敗微生物的生長，從而降低TVB-N含量。因此，動性球菌可以作為一種新型的起始發酵劑，不僅能夠在低溫發酵條件下有較高的酶活力和發酵效率，還能夠提高AAN含量并有效降低TVB-N含量。

圖52 組魚露樣品在發酵過程中AAN和TVB-N含量的變化Fig. 5 Changes in amino acid nitrogen and total volatile base nitrogen contents in fish sauce samples inoculated and not inoculated with the mixed starter culture during fermentation

2.5 揮發性風味物質分析

如表2所示，其中7 類揮發性化合物通過固相微萃取-氣相色譜-質譜方法在低鹽魚露中被檢測出來，包括6 種醇類、4 種酸類、11 種醛類、6 種酮類、4 種酯類、6 種烷烴類和2 種吡嗪類，與傳統發酵法相比[23]（18 種），此法獲得的揮發性風味物質更加豐富。發酵魚產品特殊的風味主要來自于這幾類典型揮發性風味物質，與前人的研究基本保持一致[24,26-27]。醛類是魚露中最豐富的揮發性風味物質[1]，因醛類閾值較低，因此對魚露整體風味的形成有較大的貢獻。風味物質中醛類大多數來源于不飽和脂肪酸的氧化[28]。與B組相比，A組中己醛含量較高，其中己醛是亞油酸氧化的產物，具有青草香味[29]。A組中庚醛含量明顯低于B組和C組，庚醛則是被證實的一種魚腥味物質。異戊醛和苯甲醛都屬于支鏈醛，來源于氨基酸的降解[30]，能夠賦予魚露杏仁和水果香味。A組中2-甲基丁醛和3-甲基丁醛含量均高于B組，這2 種物質被認為是魚露中最重要的揮發性醛并且對麥芽和堅果氣味有貢獻[31]。因此，接種了發酵劑（動性球菌）的魚露樣品產生了更加強烈的青草、麥芽和堅果氣味以及降低了魚腥味。

醇類由于閾值較高，可能對魚露的風味不會產生顯著的影響[32]。1-戊烯-3-醇對魚腥味的形成起重要的作用，A組中含量明顯低于B組和C組。酮類物質的生成通常與微生物的活動密切相關，主要釋放奶酪味、脂肪味和焦燃味[33]。含氮的雜環吡嗪主要通過發酵過程中的Maillard反應生成，主要產生烘焙和堅果香氣。結果表明，所篩選的4 株動性球菌對魚露特有風味的形成有重要的影響并且有助于魚露整體香氣的產生。

表2 不同處理魚露發酵樣品的揮發性風味物質Table 2 Flavor description and quantitative analysis of volatile compounds of fish sauce samples inoculated and not inoculated with the mixed starter culture

續表2

3 結 論

本研究從傳統發酵的蝦醬中分離得到4 株產低溫蛋白酶的菌株，經菌種鑒定分別為P. maritimusXJ2、P. plakortidisXJ10、P. dechangensisXJ11和P. rifietoensisXJ12。4 株動性球菌可在15～25 ℃進行快速生長代謝并且具有分泌低溫蛋白酶的能力。酶學性質分析結果顯示：動性球菌所產蛋白酶的最適溫度為40 ℃，最適pH值為9.0，并且當NaCl質量濃度小于9 g/100 mL時有較高的酶活力。研究結果表明，利用所篩選的動性球菌作為起始發酵劑在低鹽魚露的生產中具有一定的可行性和優越性。動性球菌在低溫發酵條件下具有較高的酶活力和發酵效率，促進魚露典型特征風味物質的生成且降低魚腥味，能夠有效產生傳統魚露的典型風味，降低傳統發酵的鹽濃度。本實驗得到的4 株動性球菌可作為一種有效的低鹽魚露發酵劑。