5 株低產(chǎn)乙醇的非釀酒酵母篩選及其釀造特性

張博欽，方梓莊，成池芳，張如意，段長青，燕國梁,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研發(fā)中心，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄與葡萄酒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 昌吉 832200）

由于全球氣候變暖，成熟葡萄中含糖量不斷增加，導(dǎo)致葡萄酒中乙醇含量升高[1]。葡萄酒中的乙醇可以賦予葡萄酒甜味，但其含量過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生掩蔽效應(yīng)，嚴(yán)重影響葡萄酒的風(fēng)味特征，也不利于人體健康[2-3]。因此，生產(chǎn)乙醇含量較低的葡萄酒被國內(nèi)外的釀酒師和研究人員廣泛關(guān)注[4]。目前，普遍采用反滲透、膜過濾等物理方法生產(chǎn)低醇葡萄酒[5-7]，但成本較高，同時(shí)還會(huì)造成葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)的損失，對(duì)低醇葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響[8]。除了物理降醇的方法，微生物降醇也是一種非常有效的方法，它是利用釀造特性優(yōu)良的菌株降低葡萄酒中乙醇。該方法不僅能降低葡萄酒中乙醇的含量，還能避免葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)的損失，具有成本低、控制條件簡單等優(yōu)點(diǎn)[2,9]。

在葡萄酒釀造中，主要由釀酒酵母將糖代謝成為乙醇，其乙醇合成能力的強(qiáng)弱是控制葡萄酒中乙醇含量的關(guān)鍵[10-11]。為了降低釀酒酵母乙醇合成能力，研究者利用代謝工程和進(jìn)化工程中的方法改造釀酒酵母，使乙醇的含量大幅下降，但同時(shí)會(huì)帶來一些負(fù)面的影響，如菌株發(fā)酵活性降低，乙酸含量上升，風(fēng)味物質(zhì)含量下降等問題[12-13]。因此，篩選優(yōu)良的降醇酵母一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，優(yōu)良的降醇酵母除了有低產(chǎn)乙醇的能力，還應(yīng)具有較高的生長活力和風(fēng)味物質(zhì)的合成能力。

近年來，非釀酒酵母在葡萄酒釀造中的作用受到越來越多的關(guān)注。它是葡萄酒釀造中區(qū)別于釀酒酵母的一大類酵母的統(tǒng)稱，主要包括：畢赤酵母（Pichia）、有孢圓酵母（Torulaspora）、漢遜酵母（Hanseniaspora）、梅奇酵母（Metschnikowia）、克魯維酵母（Kluyveromyces）和假絲酵母（Candida）等[14]。大量研究表明，非釀酒酵母菌株能高產(chǎn)香氣化合物（酯類、高級(jí)醇和揮發(fā)酸等），改善葡萄酒顏色和口感，提升葡萄酒的品質(zhì)[15-16]。更重要的是，一些非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵還具有降醇的效果[17-18]，主要包括美極梅奇酵母（M. pulcherrima）、星形假絲酵母（C.stellatoidea）、德爾布有孢圓酵母（T. delbrueckii）和葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）等。例如，Rossouw等[19]分別使用仙人掌有孢漢遜酵母（H. opuntiae）和葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母發(fā)酵皮諾塔吉葡萄汁，使乙醇體積分?jǐn)?shù)下降0.80%和0.60%，高級(jí)醇和酯類物質(zhì)的含量大幅提升，增加葡萄酒中花香、果香和堅(jiān)果類的香氣。Varela等[20]采用美極梅奇酵母和葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）發(fā)酵美樂葡萄汁，使葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)降低1.00%，甘油、高級(jí)醇和酯類物質(zhì)硫化物的含量增加，紅色漿果類香氣增強(qiáng)。Soden等[21]采用星形假絲酵母（Candida stellata）和釀酒酵母發(fā)酵霞多麗葡萄汁，使葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)降低0.70%，甘油和琥珀酸含量增加，葡萄酒中杏和蜂蜜的香氣顯著增強(qiáng)。

我國非釀酒酵母資源豐富，但目前國內(nèi)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)使用的非釀酒酵母大多由國外進(jìn)口[22]。這種生產(chǎn)方式不但會(huì)增加企業(yè)的生產(chǎn)成本，還會(huì)嚴(yán)重影響我國葡萄酒酵母資源的多樣性，降低葡萄酒的產(chǎn)區(qū)特色[23]。為了獲得本土低產(chǎn)乙醇的優(yōu)良非釀酒酵母菌株，本研究以新疆、東北和湖南3 個(gè)葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離得到38 株本土非釀酒酵母為研究對(duì)象，對(duì)其降醇和釀造特性進(jìn)行研究。首先通過純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，篩選得到乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇產(chǎn)率和潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)均明顯低于釀酒酵母的菌株。在此基礎(chǔ)上，將其與釀酒酵母EC1118進(jìn)行混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以期得到1 株具有低產(chǎn)乙醇且釀造特性優(yōu)良的酵母，為生產(chǎn)低醇葡萄酒提供了優(yōu)良的本土酵母資源，有助于促進(jìn)我國低醇葡萄酒的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株：從湖南、遼寧和新疆分離得到的38 株野生非釀酒酵母，保藏于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒研究中心[22]，具體如表1所示。其中CVE-HV6保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.4-161017。

YPD培養(yǎng)基：1.0%酵母浸提物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖；合成葡萄汁培養(yǎng)基[24]：200 g/L葡萄糖，0.3 g/L檸檬酸，5 g/L酒石酸，5 g/L蘋果酸，2 g/L硫酸銨，5 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L硫酸鎂，0.2 g/L氯化鈉，0.05 g/L硫酸錳和1.5 g/L酵母提取物。

葡萄汁為2017年赤霞珠葡萄汁，采自河北懷來，還原糖214.88 g/L，pH 3.24。

表1 實(shí)驗(yàn)用本土酵母菌株及分離地點(diǎn)Table 1 Species and geographical origins of indigenous strains used in this study

1.1.2 試劑

葡萄糖、果糖、濃硫酸、甘油、乙醇 北京化學(xué)試劑公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ-2611 KA立式恒溫?fù)u床 太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；JY10001電子天平 上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；DL-CJ-2ND型超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；1200高效液相色譜儀、6890氣相色譜儀、5975B質(zhì)譜儀、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱美國安捷倫科技有限公司；HPX-87H色譜柱 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 非釀酒酵母菌株純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為了初步篩選具有低產(chǎn)乙醇特性的非釀酒酵母，將38 株本土非釀酒酵母分別進(jìn)行純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以釀酒酵母EC1118作為對(duì)照。采用合成葡萄汁培養(yǎng)基進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量為106CFU/mL。發(fā)酵容器為250 mL帶有橡膠塞和立式發(fā)酵栓錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中裝有150 mL滅菌后的合成葡萄汁培養(yǎng)基。將39 株酵母接種于15 mL YPD培養(yǎng)基中活化，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)1 d，低溫（4 ℃）、6 000 r/min離心5 min后收集菌體，經(jīng)無菌水洗滌后接入錐形瓶中。各菌株在（23±1）℃下靜置發(fā)酵，每個(gè)菌株2 次生物學(xué)重復(fù)。每天測定各實(shí)驗(yàn)組的CO2質(zhì)量損失情況，若連續(xù)2 d的質(zhì)量變化小于0.2 g/100 mL，則認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取發(fā)酵液10 mL，10 000 r/min離心1 min后取上清液，于-20 ℃凍藏，用于主發(fā)酵產(chǎn)物的分析。通過比較各菌株的發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量、乙醇產(chǎn)率、潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)等指標(biāo)，初步確定具有低產(chǎn)乙醇特性的非釀酒酵母。

1.3.2 非釀酒酵母菌株混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將5 株具有低產(chǎn)乙醇潛力的非釀酒酵母與釀酒酵母EC1118進(jìn)行混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定其在混合培養(yǎng)發(fā)酵中的釀造特性。采用巴氏滅菌后的赤霞珠葡萄汁（70 ℃、15 min），接種方式為延遲接種，即先接入初步篩選得到的非釀酒酵母菌株，4 d后再接入釀酒酵母，并以釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵作為對(duì)照。非釀酒酵母和釀酒酵母的接種比例為10∶1，非釀酒酵母接種量為107CFU/mL，釀酒酵母接種量為106CFU/mL?；旌吓囵B(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在250 mL帶有橡膠塞和立式發(fā)酵栓的錐形瓶中密封進(jìn)行，每瓶裝有150 mL巴氏滅菌的葡萄汁。菌株接入錐形瓶后，在（23±1）℃下靜置發(fā)酵，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。通過測定各實(shí)驗(yàn)組中CO2質(zhì)量損失情況監(jiān)測整個(gè)發(fā)酵過程。發(fā)酵結(jié)束后，測定各實(shí)驗(yàn)組中主發(fā)酵產(chǎn)物和香氣物質(zhì)含量，進(jìn)一步比較乙醇體積分?jǐn)?shù)、香氣成分含量等指標(biāo)。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

主發(fā)酵產(chǎn)物的測定[15]：使用高效液相色譜儀進(jìn)行葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的測定。使用的色譜柱為HPX-87H（300 mm×7.8 mm），檢測器為示差折光檢測器。流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液，流速0.6 mL/min。進(jìn)樣量20 μL，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min。每個(gè)樣品測定時(shí)進(jìn)行2 次重復(fù)。

香氣化合物的測定[25]：使用氣相色譜儀和質(zhì)譜儀進(jìn)行香氣物質(zhì)的測定。使用HP-INNOWAX毛細(xì)管柱。載氣為高純氦氣（純度99.999%），流速1 mL/min。柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持5 min。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子電離，離子源能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z30～350。每個(gè)樣品測定時(shí)進(jìn)行2 次重復(fù)。

通過自動(dòng)質(zhì)譜解卷積和鑒定系統(tǒng)（AMDIS）和NIST 11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫確定香氣化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息。利用質(zhì)譜全離子掃描（Scan）圖譜對(duì)所測香氣化合物進(jìn)行定性和定量分析。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)已建立的相同色譜條件下所測香氣化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析，通過配制該香氣化合物在模擬酒溶液（合成酒溶液為2 g/L葡萄糖、7 g/L酒石酸和12%乙醇的水溶液，NaOH調(diào)pH值至3.3。將混合香氣標(biāo)準(zhǔn)品配制成15 個(gè)梯度）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.3.4 主要篩選指標(biāo)的計(jì)算[26]

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 非釀酒酵母菌株純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

表2 單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵相關(guān)參數(shù)Table 2 Fermentation parameters with single cultures

38 株本土非釀酒酵母及1 株釀酒酵母的生長及主發(fā)酵產(chǎn)物如表2所示。釀酒酵母EC1118的生長速率明顯高于非釀酒酵母，釀酒酵母EC1118的CO2質(zhì)量損失量可達(dá)1.32 g/（150 mL·d），而非釀酒酵母的CO2質(zhì)量損失量在0.14～0.59 g/（150 mL·d）。其中生長速率較快的5 株非釀酒酵母分別為CVE-HV6（0.59 g/（150 mL·d））、CVELT1（0.54 g/（150 mL·d））、CVE-TD12（0.41 g/（150 mL·d））、CVE-TD28（0.40 g/（150 mL·d））、CVE-TD8（0.39 g/（150 mL·d））。發(fā)酵結(jié)束后，釀酒酵母的葡萄糖利用率為99.39%，而非釀酒酵母的葡萄糖利用率在13.32%～54.32%。釀酒酵母的乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)12.41%，非釀酒酵母的乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.73%～6.10%。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)較低的5 株非釀酒酵母分別為CVE-PK36（1.73%）、CVE-RM3（1.92%）、CVERM6（2.28%）、CVE-PK9（2.82%）、CVE-LT1（2.90%）。由于非釀酒酵母不能單獨(dú)完成整個(gè)發(fā)酵，發(fā)酵液中存有大量的葡萄糖，導(dǎo)致非釀酒酵母發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)較低。這不足以說明非釀酒酵母低產(chǎn)乙醇的釀造特性。因此，本研究引入了乙醇產(chǎn)率和潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)2 個(gè)指標(biāo)，以評(píng)價(jià)非釀酒酵母產(chǎn)乙醇的特性[26]。其中釀酒酵母EC1118的乙醇產(chǎn)率為49.26%，非釀酒酵母的乙醇產(chǎn)率為26.70%～51.70%，其中產(chǎn)率最低的5 株非釀酒酵母分別為CVE-RM3（26.79%）、CVEHU42（32.03%）、CVE-HU13（38.06%）、CVE-HU25（38.13%）和CVE-RM6（38.65%）。釀酒酵母EC1118的潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)為12.49%，非釀酒酵母的潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6.79%～13.11%。其中數(shù)值最低的5 株非釀酒酵母分別為CVE-RM3（6.79%）、CVE-HU42（8.12%）、CVE-HU13（9.65%）、CVE-HU25（9.67%）和CVE-RM6（9.80%）。

根據(jù)非釀酒酵母的生長速率、乙醇產(chǎn)率、潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)等指標(biāo)以及非釀酒酵母種屬的情況，初步篩選得到5 株非釀酒酵母，分別為紅酵母CVE-RM3、葡萄汁有孢漢遜酵母CVE-HU42、庫德里阿茲威氏畢赤酵母CVE-PK1、美極梅奇酵母CVE-MP33、葡萄園有孢漢遜酵母CVE-HV6。使用這些菌株進(jìn)行葡萄汁發(fā)酵后，它們的乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇產(chǎn)率和潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)均遠(yuǎn)低于釀酒酵母EC1118，具有生產(chǎn)低醇葡萄酒的潛力。

2.2 非釀酒酵母菌株與釀酒酵母混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

一般情況下，非釀酒酵母不能單獨(dú)進(jìn)行乙醇發(fā)酵，需要與釀酒酵母混合培養(yǎng)以保證乙醇發(fā)酵的順利完成[27]。因此，分別將這5 株非釀酒酵母與釀酒酵母EC1118進(jìn)行混合培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（RM3/SC、HV6/SC、MP33/SC、HU42/SC和PK1/SC），進(jìn)一步評(píng)價(jià)其釀造特性，并以釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵（SC）為對(duì)照，測定各實(shí)驗(yàn)組中酵母菌株的發(fā)酵活性及最終樣品中主發(fā)酵產(chǎn)物和香氣成分的含量。

2.2.1 發(fā)酵活性

各實(shí)驗(yàn)組酵母菌株的發(fā)酵活性（以CO2質(zhì)量損失量表示）如圖1所示。對(duì)照組SC在第11天完成乙醇發(fā)酵，而混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組也能夠在第11～13天完成乙醇發(fā)酵。對(duì)照組SC的CO2質(zhì)量損失速度明顯快于混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組，最大CO2質(zhì)量損失量可達(dá)11.34 g/150 mL。在混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組中，HV6/SC的CO2質(zhì)量損失速度最快，而其余實(shí)驗(yàn)組在接入釀酒酵母后才開始迅速增加。發(fā)酵結(jié)束后，混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組的CO2質(zhì)量損失量為9.25～10.65 g/150 mL，MP33/SC實(shí)驗(yàn)組的質(zhì)量損失量最大。

圖1 不同發(fā)酵條件下各實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵活性Fig. 1 Fermentation abilities of mixed cultures

2.2.2 主發(fā)酵產(chǎn)物分析

表3 不同發(fā)酵條件下主發(fā)酵產(chǎn)物的含量Table 3 Contents of major products from alcoholic fermentation with mixed cultures

如表3所示，乙醇發(fā)酵后，各實(shí)驗(yàn)組中葡萄糖和果糖的總量降低到2 g/L以下，甘油質(zhì)量濃度為6.36（SC）～7.58 g/L（PK1/SC）。5 個(gè)混合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組均能夠提升甘油含量，增幅為4.56%～34.91%。對(duì)照組SC中乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.46%，在混合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.74%～10.19%。其中，只有HV6/SC、MP33/SC和HU42/SC中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組SC，分別下降了0.72%、0.16%和0.14%。

2.2.3 揮發(fā)性香氣成分分析

香氣是葡萄酒最重要的感官品質(zhì)之一[28]。本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法測定了各實(shí)驗(yàn)組中香氣成分的含量，結(jié)果如表4所示。本實(shí)驗(yàn)共檢測到36 種香氣物質(zhì)，主要包括10 種酯類、11 種高級(jí)醇、5 種揮發(fā)酸、3 種羰基化合物、3 種萜烯類化合物、1 種降異戊二烯化合物等。

酯類物質(zhì)能為葡萄酒提供令人愉悅的花香和果香，是葡萄酒香氣的重要組成部分[29]。乙醇發(fā)酵后，各實(shí)驗(yàn)組酯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度從低到高依次為6 145.41（SC）、7 206.69（RM3/SC）、10 512.71（MP33/SC）、15 862.08（PK1/SC）、22 364.34 μg/L（HV6/SC）和26 797.16 μg/L（HU42/SC）。相比于對(duì)照組SC，5 種非釀酒酵母混合培養(yǎng)均能夠增加酯類物質(zhì)總量，增幅為17.27%～336.05%。其中，共有5 種酯類物質(zhì)的香氣活力值（odor activity value，OAV）超過0.1，分別為乙酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯。乙酸乙酯是葡萄酒中重要的香氣成分，其質(zhì)量濃度低于150 mg/L能夠增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性[22]。各實(shí)驗(yàn)組中乙酸乙酯質(zhì)量濃度為5.36～26.29 mg/L，HU42/SC中乙酸乙酯的含量最高，是對(duì)照組SC的4.90 倍。己酸乙酯和癸酸乙酯能夠?yàn)槠咸丫茙砬嗵O果和香蕉等香氣[30]，對(duì)照組SC中這2 種酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，分別為24.04 μg/L和295.99 μg/L。乙酸異戊酯質(zhì)量濃度為171.87（PK1/SC）～177.40 μg/L（RM3/SC），各實(shí)驗(yàn)組之間差異不大。而乙酸苯乙酯在各實(shí)驗(yàn)組之間差異明顯，其中HV6/SC質(zhì)量濃度最高（1 920.14 μg/L），是對(duì)照組SC的36.04 倍。

高級(jí)醇是酵母代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物，當(dāng)葡萄酒中的高級(jí)醇含量低于300 mg/L時(shí)，對(duì)葡萄酒香氣具有積極貢獻(xiàn)，可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性。但當(dāng)其總量超過400 mg/L時(shí)，會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味，導(dǎo)致感官葡萄酒品質(zhì)下降[30]。各實(shí)驗(yàn)組中高級(jí)醇的總量由低到高分別為17 032.34（PK1/SC）、18 584.63（HU42/SC）、19 658.22（HV6/SC）、20 737.41（SC）、21 207.50 μg/L（RM3/SC）和22 275.87 μg/L（MP33/SC）。所檢測到的11 種高級(jí)醇中只有1-己醇、異戊醇和2-苯乙醇的OAV超過0.1。其中，1-己醇會(huì)給葡萄酒帶來生青味和植物味，其質(zhì)量濃度為570.22（MP33/SC）～942.97 μg/L（HV6/SC）。異戊醇和2-苯乙醇分別為葡萄酒帶來溶劑味和玫瑰味，MP33/SC中這2 種物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，為10 332.18 μg/L和6 104.08 μg/L，分別是對(duì)照組SC的1.01 倍和1.50 倍。

揮發(fā)酸能夠提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性，是葡萄酒中重要的一類香氣物質(zhì)[15]。各實(shí)驗(yàn)組中揮發(fā)酸總量由低到高依次是267.91（PK1/SC）、347.13（HU42/SC）、516.70（MP33/SC）、573.64（RM3/SC）、820.72（HV6/SC）、914.55 μg/L（SC）。所檢測到的5 種揮發(fā)酸中己酸和辛酸的OAV超過了0.1，它們具有酸腐味和脂肪味，含量過高降低葡萄酒的感官品質(zhì)。對(duì)照組SC中這2 種揮發(fā)酸的含量最高，分別為其余實(shí)驗(yàn)組的1.61～7.46 倍和1.63～12.52 倍。除此之外，癸醛、里那醇、4-萜品醇、β-大馬士酮和4-乙基苯酚的OAV也超過了0.1。其中，里那醇在各實(shí)驗(yàn)組中差異較大，HV6/SC中質(zhì)量濃度最高（21.52 μg/L），相比于對(duì)照組SC提升了49.03%，能夠增加葡萄酒中的花香品質(zhì)。

表4 不同發(fā)酵條件下香氣成分的含量Table 4 Concentrations of aroma compounds produced by alcoholic fermentation with different mixed cultures

2.2.4 香氣成分的主成分分析（principle compounds analysis，PCA）

為了直觀展示各實(shí)驗(yàn)組之間的差異，對(duì)于OAV大于0.1的15 種香氣物質(zhì)進(jìn)行PCA。由圖2可知，2 個(gè)PC的總貢獻(xiàn)率為70.3%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為40.0%，PC2的貢獻(xiàn)率為30.3%。其中，HV6/SC位于第1象限，與里那醇、1-己醇、乙酸苯乙酯和4-乙基苯酚相關(guān)性強(qiáng)；對(duì)照組SC位于第2象限，與癸酸乙酯、癸醛、4-萜品醇、辛酸和己酸的聯(lián)系緊密；MP33/SC和RM3/SC位于第3象限，與2-苯乙醇有較大關(guān)聯(lián)；PK1/SC和HU42/SC位于第4象限，與乙酸乙酯相關(guān)。通過PCA發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)添加非釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SC均有較大的香氣差異，不同非釀酒酵母能夠增加葡萄酒香氣的多樣性，為釀造不同風(fēng)格的葡萄酒提供更多的選擇。

圖2 不同發(fā)酵條件下香氣物質(zhì)的PCA圖Fig. 2 Principal component analysis (PCA) plot for aroma compounds produced with different mixed cultures

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著對(duì)非釀酒酵母的研究越來越多，通過非釀酒酵母降低葡萄酒中乙醇的含量是一種簡單且可行的方案。由于非釀酒酵母對(duì)于乙醇的轉(zhuǎn)化能力遠(yuǎn)低于釀酒酵母，在發(fā)酵過程中首先加入非釀酒酵母可以消耗大量碳源，從而降低葡萄酒中最終乙醇含量。更為重要的是，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵能夠改善葡萄酒的口感、顏色和香氣復(fù)雜性，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生積極作用。

非釀酒酵母種類眾多，不同非釀酒酵母的降醇效果存在很大的差異。其中，被廣泛報(bào)道的美極梅奇酵母具有較強(qiáng)降醇能力，能夠使葡萄酒中乙醇的含量下降0.9%～1.6%[32-34]。本實(shí)驗(yàn)所篩選得到的CVE-MP33也具有一定的降醇能力，但效果并不顯著，可使葡萄酒中乙醇的含量降低0.16%。這可能是由于CVE-MP33的生長能力不強(qiáng)：前4 d的CO2質(zhì)量損失量為1.29 g/150 mL，僅為對(duì)照組SC的13.63%。雖然該酵母在前期單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中具有較低的乙醇體積分?jǐn)?shù)（3.31%）、乙醇產(chǎn)率（39.92%）和潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)（10.12%），但過低的生長能力限制了其在混合培養(yǎng)發(fā)酵中降醇作用的發(fā)揮。在香氣方面，CVE-MP33能夠增加葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和2-苯乙醇含量。其中，2-苯乙醇含量在各實(shí)驗(yàn)組中最高，是對(duì)照組SC的1.50 倍，能夠賦予葡萄酒玫瑰花香和蜂蜜甜香。Varela等[35]在霞多麗和西拉葡萄汁中接種美極梅奇酵母和葡萄汁酵母使葡萄酒中2-苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量顯著增加，這與本研究結(jié)果一致。但所選的CVE-MP33酵母生長活性較低，對(duì)葡萄酒中乙醇含量的降低效果有限，不適合低醇葡萄酒的生產(chǎn)。

葡萄汁有孢漢遜酵母也具有降醇效果，可使葡萄酒中乙醇含量降低0.94%～1.21%[17,34]。Laura[18]和Rossouw[19]等發(fā)現(xiàn)這種酵母會(huì)產(chǎn)生較多的乙酸乙酯，對(duì)葡萄酒的香氣品質(zhì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的CVEHU42可使葡萄酒中乙醇含量降低0.14%，也會(huì)高產(chǎn)乙酸乙酯，其質(zhì)量濃度可達(dá)26.3 mg/L，是對(duì)照組SC的4.90 倍。本研究CVE-HU42中乙酸乙酯的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于300 mg/L，能夠增加葡萄酒中香氣復(fù)雜性和果香。但是考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中使用葡萄汁有孢漢遜酵母CVEHU42可能出現(xiàn)乙酸乙酯過量的情況，該菌株的釀造特性還需要更加細(xì)致的評(píng)價(jià)，并逐步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模。

葡萄園有孢漢遜酵母是葡萄酒釀造中一種重要的非釀酒酵母，該酵母具有高產(chǎn)乙酸苯乙酯的特性，能夠賦予葡萄酒玫瑰花香和水果香，提升葡萄酒的香氣品質(zhì)。Medina等[36]在霞多麗白葡萄汁中接種葡萄園有孢漢遜酵母02/5A，能夠使乙酸苯乙酯的含量提升10.21 倍，增加葡萄酒中香蕉、梨、蘋果和柑橘等水果的香氣。Lleixà等[37]在馬卡貝澳白葡萄汁中接種葡萄園有孢漢遜酵母T02/5AF，可使乙酸苯乙酯含量提升49.40 倍，增加葡萄酒中花香和果香。但目前還沒有該酵母降醇效果的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄園有孢漢遜酵母CVE-HV6與釀酒酵母混合發(fā)酵可使葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)降低0.72%（與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比）。并且其高產(chǎn)乙酸苯乙酯（可達(dá)1 920.14 μg/L），是對(duì)照組SC的36.04 倍。CVEHV6還具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，前4 d CO2質(zhì)量損失量可達(dá)7.42 g/150 mL，是釀酒酵母的78.35%，明顯高于其余非釀酒酵母（圖1）。該菌株在低產(chǎn)乙醇的同時(shí)，還具有較高的生長繁殖能力以及合成香氣化合物的能力，具有生產(chǎn)低醇葡萄酒的潛力。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從38 株本土非釀酒酵母中篩選得到1 株低產(chǎn)乙醇的菌株葡萄園有孢漢遜酵母CVE-HV6。該菌株在純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)（5.59%）、乙醇產(chǎn)量（44.11 g/L）和潛在乙醇體積分?jǐn)?shù)（10.29%）均遠(yuǎn)低于釀酒酵母EC1118；與釀酒酵母EC1118混合發(fā)酵可使葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)下降0.72%。CVE-HV6菌株還具有較強(qiáng)的生長活性，與釀酒酵母混合發(fā)酵能夠顯著增加乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-苯乙醇和里那醇的含量，降低己酸和辛酸的含量，從而改善葡萄酒的香氣輪廓。未來將進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件（改變非釀酒酵母的接種方式和接種量），以繼續(xù)提高CVE-HV6菌株降醇效果，滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。