產黃青霉β-甘露聚糖酶的高效表達、性質及應用

甄紅敏，華曉晗，馬俊文，溫永平,3，李延嘯,*，閆巧娟,*，江正強

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業大學工學院，北京 100083；3.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 100101）

β-甘露聚糖酶是一種能夠特異性水解甘露聚糖主鏈中β-1,4-糖苷鍵的水解酶，產物主要為不同聚合度的甘露寡糖[1]。β-甘露聚糖酶在細菌、放線菌、真菌、植物和一些低等動物中廣泛存在，微生物來源的β-甘露聚糖酶產量高、成本低、提取簡單，因而最具應用潛力[2]。根據氨基酸序列相似性，β-甘露聚糖酶可分為4 個糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，即GH5、GH26、GH113和GH134家族。大部分動植物和真菌來源的β-甘露聚糖酶和部分細菌β-甘露聚糖酶屬于GH5家族，多數細菌β-甘露聚糖酶和少數真菌β-甘露聚糖酶則屬于GH26家族[3]。GH113家族的β-甘露聚糖酶主要來源于脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillussp.）等少數細菌[4]；GH134家族的β-甘露聚糖酶則主要來源于構巢曲霉（Aspergillus nidulans）和微孢根霉（Rhizopus microsporus）等[5]。作為一種重要的糖苷水解酶，β-甘露聚糖酶的應用范圍已涵蓋食品、飼料、造紙等多個行業[6]。

生產甘露寡糖是β-甘露聚糖酶的一個重要應用。甘露寡糖的制備方法主要包括物理降解、化學降解以及酶法降解[7-9]。與物理和化學法相比，酶法降解條件溫和、過程可控、成本低廉、環境友好，是制備甘露寡糖最常用的方法。目前，甘露寡糖已被證實具有促進益生菌增殖、降低血脂、控制血糖等功能活性[10]。實現β-甘露聚糖酶的高效表達，是應用于甘露寡糖生產的前提和基礎。雖然一些β-甘露聚糖酶已在畢赤酵母（Pichia pastoris）中進行高效表達，但它們大多數屬于GH5家族，如米黑根毛霉（R. miehei）來源的RmMan5A、mRmMan5A和毛殼菌（Chaetomiumsp.）來源的CsMan5A等[11-13]，僅有少數GH26家族β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中實現了高效表達，如芽孢桿菌（Bacillussp.）來源的mannS和Bman26/MEIR[14-15]。這些GH26家族的β-甘露聚糖酶難以滿足不同大規模應用的需要。此外，不同家族β-甘露聚糖酶的水解特性明顯不同，如毛殼菌CQ31來源的GH5家族β-甘露聚糖酶CsMan5A水解魔芋粉等甘露聚糖主要產生聚合度2～4的寡糖和一些甘露糖[11]；牛瘤胃宏基因組來源的GH26家族β-甘露聚糖酶CrMan26的最佳水解底物為角豆膠等半乳甘露聚糖[16]。不同來源β-甘露聚糖酶水解魔芋粉所得產物也有所不同，如Talaromyces cellulolyticus來源的β-甘露聚糖酶水解魔芋粉可獲得聚合度3～7的甘露寡糖，單糖組分含量較少[17]；而枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）來源的β-甘露聚糖酶水解魔芋粉，甘露寡糖得率為57.8%，且會產生較多的甘露糖和葡萄糖[18]。因此，開發更多適用于甘露寡糖生產的甘露聚糖酶，并實現其高效生產，對甘露寡糖的生產具有重要意義。

產黃青霉（Penicillium chrysogenum）是一種重要的工業用真菌，主要用于生產青霉素和多種有機酸，同時能夠分泌木聚糖酶、淀粉酶等多種糖苷水解酶[19-20]。本研究從產黃青霉基因組中發掘出一個假想蛋白（GenBank No.CAP97963.1），預測為GH26家族β-甘露聚糖酶（PcMan26A），將其基因導入畢赤酵母GS115中高效表達，研究該酶酶學性質，并用于水解魔芋粉制備魔芋甘露寡糖，旨在為利用魔芋粉制備魔芋甘露寡糖提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母GS115 北京全式金生物技術有限公司；載體pPIC9K 美國Invitrogen公司；甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖） 愛爾蘭Megazyme公司；槐豆膠、瓜爾膠 美國Sigma-Aldrich公司；魔芋粉（葡甘露聚糖含量≥80%，甘露糖/葡萄糖=1.62） 湖北強森魔芋科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 Infinity II system高效液相色譜儀、1260 Infinity system凝膠排阻色譜儀、G7162A型示差折光檢測器美國Agilent公司；?KTA蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司；5 L發酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1β-甘露聚糖酶基因（PcMan26A）的克隆及表達

根據NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）信息，發掘出一段預測為GH26家族β-甘露聚糖酶基因（GenBank Accession No.CAP97963.1）。根據該基因序列設計特異性擴增引物PcMan26AF（5′-GATCCTCCGGA ATTCGCTGGTTTGTCTTACGATAATATTGATAA-3′）和PcMan26AR（5′-GATACAAGCGGCCGCTTAATTCT TTTTCTTATCCTCAATAGTAACAAC-3′），以產黃青霉的cDNA為模板擴增該基因（PcMan26A）。聚合酶鏈式反應擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸8 min。擴增產物經限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切后與載體pPIC9K連接，得到重組質粒pPIC9K-PcMan26A，利用限制性內切酶SalI線性化后電轉化畢赤酵母感受態細胞。β-甘露聚糖酶的分泌表達及高拷貝轉化子的篩選參考Li Yanxiao等[12]的方法。高拷貝轉化子篩選時，用2～3 mL無菌水重懸MD培養基上的重組菌，分別涂布在含有不同質量濃度（1.0～8.0 mg/mL）遺傳霉素G418的YPD-G418篩選培養基上，在30 ℃倒置培養3 d。挑取篩選培養基上的單菌落接種于5 mL甘油發酵（buffered minimal glycerol-complex medium，BMGY）培養基，在30 ℃、200 r/min下振蕩培養至OD600nm達2～6，3 000×g離心5 min收集細胞，重懸于10 mL誘導表達（buffered methanol-complex medium，BMMY）培養基進行誘導表達，每24 h加甲醇（終體積分數0.5%），誘導3 d后測定酶活力。

1.3.2 高密度發酵產PcMan26A

利用5 L發酵罐進行畢赤酵母高密度發酵，方法參考文獻[21]。在200 mL BMGY培養基中接種重組畢赤酵母，于30 ℃、200 r/min培養至OD600nm達到10.0，得到種子液；發酵罐內1.5 L BSM培養基滅菌后，用氨水調節pH值至4.0，溫度30 ℃，轉速600 r/min，通氣量1 vvm；隨后將種子液接種于發酵罐中，發酵18～24 h，罐內甘油耗盡后，繼續流加甘油4～5 h；待發酵液OD600nm達180～220，饑餓30 min；隨后流加100%甲醇誘導培養基，并調節pH值至6.0、轉速800 r/min、通氣量1.5 vvm，通過控制流加速度和空氣流量使罐內溶氧保持在20%以上，繼續發酵168 h，并每隔12 h取樣，分析PcMan26A酶活力、蛋白含量和菌體濕質量。

1.3.3PcMan26A的純化

發酵液10 000×g離心10 min，上清液4 ℃透析12 h，透析液為20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）。利用Q-Sepharose陰離子交換層析純化PcMan26A，用Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L，pH 8.0）平衡Q-Sepharose柱，上樣后用0～500 mmol/L NaCl溶液（20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）線性洗脫（12 個柱體積），流速為1.0 mL/min，整個過程在?KTA純化系統上進行。收集有酶活力的組分4 ℃透析12 h，透析液為20 mmol/L醋酸緩沖液（pH 6.0）。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純酶和Endo H處理后的酶[22]。

對PcMan26A進行酶譜分析時，在分離膠中添加1 mg/mL槐豆膠，電泳結束后用25%（V/V）異丙醇溶液浸泡3 次（15 min/次），用50 mmol/L醋酸緩沖液（pH 6.0）漂洗電泳膠3 次（10 min/次），隨后將電泳膠浸泡于50 mmol/L醋酸緩沖液（pH 6.0）置于40 ℃反應30 min，并用0.5 g/L剛果紅溶液染色20 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色20 min，最后用0.5%（V/V）乙酸溶液定色。

1.3.4PcMan26A酶活力和蛋白濃度的測定

以甘露糖為標準，用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定PcMan26A酶活力[23]。將900 μL槐豆膠溶液（5 mg/mL，50 mmol/L醋酸緩沖液，pH 6.0）與100 μL稀釋后的酶液混合均勻后，50 ℃反應10 min，加入1 mL DNS試劑沸水浴15 min顯色，隨后加入1 mL 40%酒石酸鉀鈉溶液并迅速冷卻，在540 nm波長處測定吸光度。酶活力定義：每分鐘產生1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。以牛血清蛋白為標準，參照Lowry等[24]的方法測定蛋白含量。

1.3.5PcMan26A的酶學性質

測定最適pH值時，用50 mmol/L不同pH值的緩沖液按照標準方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算各pH值下的相對酶活力。緩沖體系為：檸檬酸緩沖液（pH 3.0～6.0）、醋酸緩沖液（pH 4.0～6.0）、MES緩沖液（pH 5.5～6.5）、磷酸緩沖液（pH 6.0～8.0）、HEPS緩沖液（pH 6.5～8.0）和CHES緩沖液（pH 8.0～10.0）。測定pH值穩定性時，用上述緩沖液稀釋酶液，并在30 ℃保溫30 min，按標準方法測定酶活力，以未經處理的酶液為100%，計算各pH值下的殘余酶活力。

測定最適溫度時，在30～70 ℃按照標準方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。測定溫度穩定性時，將適當稀釋后的酶液于30～70 ℃保溫30 min，按照標準方法測定酶活力，以未經處理的酶液為100%，計算各溫度下的殘余酶活力。

1.3.6PcMan26A的底物特異性和水解特性

以槐豆膠、瓜爾膠和魔芋粉等為底物（5 mg/mL），按照標準方法測定酶活力，計算該酶對不同底物的比活力。

測定水解特性時，用醋酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）分別配制10 mg/mL的甘露聚糖（魔芋粉、槐豆膠和瓜爾膠）和甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖），添加5 U/mL的PcMan26A 40 ℃水解12 h，在不同時間點取樣。用薄層層析檢測產物組成，標準品為甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖。

1.3.7PcMan26A水解魔芋粉

在高速攪拌下，將100.0 g魔芋粉溶于500 mL醋酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0），置于40 ℃預熱30 min，加入PcMan26A（加酶量200 U/mL），在40 ℃、600 r/min下水解12 h，之后沸水浴滅酶20 min。10 000×g離心15 min，取上清液濃縮凍干后即為魔芋甘露寡糖。

魔芋甘露寡糖的組成用高效液相色譜-示差折光檢測器（high performance liquid chromatography-differential refractive index detector，HPLC-RID）分析測定。樣品過0.22 μm濾膜上樣，色譜柱為Shodex Sugar KS-802（7.8 mm×300 mm），柱溫為65 ℃，流動相為純水，流速0.8 mL/min，檢測器溫度35 ℃，標準品為甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。

2 結果與分析

2.1 PcMan26A的基因克隆

產黃青霉來源的PcMan26A全長1 017 bp，編碼338 個氨基酸，屬于GH26家族。經SignalP 4.1分析，N端有一個信號肽序列，含有18 個氨基酸。氨基酸序列同源比對分析表明（圖1），該酶與黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88來源的β-甘露聚糖酶（GenBank No.A2R6F5.1）相似性最高，為67.8%；其次分別為Thermothelomyces thermophilusATCC 42464（GenBank No.G2Q4H7.1）、構巢曲霉（A. nidulans）FGSC A4（GenBank No.Q5AWB7.1）、海洋紅嗜熱鹽菌（Rhodothermus marinus）DSM 4252（GenBank No.P49425.3）和Piromycessp.（GenBank No.P55296.1）來源的β-甘露聚糖酶，其相似性分別為43.2%、41.8%、40.5%和31.0%。通過氨基酸序列比對預測，該酶中第189位和281位的谷氨酸殘基（Glu189和Glu281）分別為該酶親核試劑和廣義酸堿。

圖1 產黃青霉PcMan26A與其他同家族β-甘露聚糖酶多重序列比對Fig. 1 Amino acid sequence similarity between PcMan26A and other β-mannanases from the family GH 26

2.2 PcMan26A的高效表達及純化

通過高拷貝轉化子篩選，1 株高產重組菌株的搖瓶發酵酶活力為261.8 U/mL。將該重組菌株進行高密度發酵，168 h后菌體濕質量達500 g/L，酶活力和蛋白質量濃度分別達到25 200 U/mL和10.1 mg/mL（圖2A）。甲醇誘導開始后，發酵液中首先出現分子質量60 kDa的蛋白條帶，發酵48 h后出現47 kDa的蛋白條帶；隨著誘導時間延長，2 條蛋白條帶均逐漸變粗（圖2B）。

圖2 畢赤酵母高密度發酵產PcMan26A歷程Fig. 2 Expression of PcMan26A in P. pastoris GS115 during high cell density fermentation

通過陰離子交換層析一步純化得到電泳級純酶（PcMan26A），回收率為80.7%，純化倍數為1.2 倍。PcMan26A在電泳膠上呈2 條不同的條帶，其分子質量分別為60 kDa和47 kDa，均有明顯拖尾現象；酶譜分析表明，2 條蛋白均有β-甘露聚糖酶活性（圖3），這表明該酶在畢赤酵母中表達可能發生了不同程度的糖基化。去糖基化酶Endo H處理后，PcMan26A在電泳膠上仍然呈2 條帶，但分子質量分別降低至50 kDa和39 kDa，沒有出現拖尾現象，表明畢赤酵母表達的PcMan26A確實發生了糖基化。

圖3 PcMan26A的純化圖Fig. 3 SDS-PAGE profiles of crude and purified PcMan26A

2.3 PcMan26A的酶學性質

如圖4所示，該酶的最適pH值為6.0，pH 4.0～8.0處理30 min仍保留80%以上的酶活力；該酶的最適溫度為50 ℃，在45 ℃下處理30 min仍保留90%以上的酶活力。

圖4 PcMan26A的最適pH值（A）、pH值穩定性（B）、最適溫度（C）和溫度穩定性（D）Fig. 4 Optimal pH (A), pH stability (B), optimal temperature (C), and thermostability (D) of PcMan26A

2.4 PcMan26A的底物特異性和水解特性

圖5 PcMan26A的水解特性Fig. 5 TLC analysis of mannans and manno-oligosaccharides hydrolyzed by PcMan26A

PcMan26A對槐豆膠的比活力為2 967.7 U/mg，對魔芋粉和瓜爾膠的比活力分別為3 581.0 U/mg和1 442.1 U/mg。水解特性分析表明（圖5），該酶水解槐豆膠時主要產生甘露二糖、甘露三糖和一些聚合度大于3的甘露寡糖；水解魔芋粉時主要產生聚合度大于4的甘露寡糖；水解瓜爾膠時主要產生聚合度大于5的甘露寡糖。此外，該酶的最小水解底物為甘露五糖，主要產生甘露四糖和少量的甘露糖。

2.5 魔芋甘露聚糖的制備

利用PcMan26A在最適條件下（200 g/L魔芋粉，加酶量200 U/mL）水解魔芋粉12 h后，魔芋粉中葡甘露聚糖的水解率為91.8%，魔芋甘露寡糖總得率為86.2%。經HPLC分析，產物主要為聚合度大于4的甘露寡糖（圖6）。此外，甘露六糖保留時間右側寡糖組分的峰面積超過總峰面積的50%，符合我國頒布的“新食品原料”（2013年第10號公告）目錄[25]中的相關規定。

圖6 魔芋甘露寡糖的組分分析Fig. 6 HPLC profile showing the composition of konjac manno-oligosaccharides

3 討 論

本研究從產黃青霉基因組中發掘了一個GH26家族PcMan26A，該酶與黑曲霉CBS 513.88來源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%），與其他GH26家族β-甘露聚糖酶同源性均在45%以下（圖1），表明該酶為一個新型GH26家族β-甘露聚糖酶。經高密度發酵，該酶的畢赤酵母發酵液蛋白質量濃度可達10.1 mg/mL（圖2），顯著高于芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等來源的β-甘露聚糖酶，它們在畢赤酵母中的表達水平僅為2.2～6.6 mg/mL[15,26]。雖然該酶產酶水平低于一些GH5家族β-甘露聚糖酶，如毛殼菌CQ31來源的CsMan5A（50 030 U/mL）[11]和米黑根毛霉CAU432來源的RmMan5A（85 200 U/mL）[12]，但其產酶水平明顯高于大多數GH26家族β-甘露聚糖酶，如黑曲霉CBS 513.88來源的Man26A（5 069 U/mL）[27]和枯草芽孢桿菌TBS2來源的ReTMan26（5 435 U/mL）[28]。

該酶在電泳膠上呈47 kDa和60 kDa兩條蛋白條帶，酶譜分析表明它們均具有β-甘露聚糖酶活性（圖3）。通過NetNGlyc和NetOGlyc分析，PcMan26A氨基酸序列中有3 個N-糖基化位點（Asn147-Ser148-Thr149、Asn154-Gly155-Thr156和Asn269-Val270-Thr271）和4 個O-糖基化位點（Ser13、Thr29、Ser148和Thr149）。利用Endo H處理后，2 個條帶分別降低至39 kDa和50 kDa，其中39 kDa的條帶與該酶的預測分子質量（38 kDa）一致，而另一個條帶的分子質量（50 kDa）則高于預測分子質量。這可能是由于該酶在畢赤酵母中同時發生了N-糖基化和O-糖基化，Endo H只能去除N-糖基化，而無法去除O-糖基化。

PcMan26A的最適pH值為6.0，在酸性條件下具有較高催化活性（圖4），這與大部分真菌來源β-甘露聚糖酶類似，如米曲霉（A. oryzae）RIB40、嗜熱毀絲菌（Myceliophthora thermophila）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）MGQ2來源的β-甘露聚糖酶[29-31]。其最適pH值明顯低于一些細菌來源β-甘露聚糖酶，如腸桿菌（Enterobactersp.）N18（pH 7.5）、嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）BCRC 19214（pH 8.0）和芽孢桿菌N16-5（pH 9.5）來源的β-甘露聚糖酶[32-34]。該酶的最適溫度為50 ℃，與大部分微生物β-甘露聚糖酶最適溫度（40～60 ℃）相似[14,35]，但明顯低于一些嗜熱微生物來源β-甘露聚糖酶，如費氏新薩托菌（Neosartorya fischeri）P1的rMan5P1（80 ℃）[36]、來源于嗜熱裂孢菌BCRC 19214的Tfu-man（80 ℃）[32]和來源于Talaromyces leycettanusJCM12802的TlMan5A（90 ℃）[37]。

不同家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物有所不同。大部分GH5家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物為甘露三糖，多數GH26家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物為甘露四糖[38]。枯草芽孢桿菌來源的GH26家族β-甘露聚糖酶Bman26/MEIR水解甘露四糖主要產生甘露二糖以及少量甘露糖和甘露三糖[14]；Clostridium thermocellum來源的GH26家族β-甘露聚糖酶則具有糖苷酶活性，其能將甘露二糖水解為甘露糖[39]。與大部分GH26家族β-甘露聚糖酶不同，PcMan26A的最小水解底物為甘露五糖，能將甘露五糖水解為甘露糖和甘露四糖，不產生甘露二糖和甘露三糖（圖5），這有利于水解時甘露寡糖組分的積累。利用該酶水解槐豆膠、魔芋粉、瓜爾膠等底物時，產物主要為高聚合度寡糖，幾乎不產生甘露糖，表明該酶適用于甘露寡糖生產。利用PcMan26A水解200 g/L魔芋粉所得魔芋甘露寡糖中，主要為聚合度大于4的寡糖組分（圖6）。與低聚合度的甘露寡糖相比，高聚合度的甘露寡糖在人體腸道內發酵速度更慢，能夠順利到達人體遠端結腸，促進遠端結腸中有益菌生長增殖[40]。因此，將上述魔芋甘露寡糖與低聚木糖、低聚果糖等低聚合度寡糖復配，對整個結腸（近端和遠端）中有益菌生長均可起到促進作用。

4 結 論

本研究將一個來源于產黃青霉GH26家族的PcMan26A在畢赤酵母中高效表達，經高密度發酵產酶水平達25 200 U/mL。該酶對魔芋粉具有最高的比活力，水解甘露聚糖主要產生一些高聚合度（＞4）甘露寡糖，在甘露寡糖酶法制備中具有應用潛力。利用PcMan26A水解魔芋粉成功制備得到魔芋甘露寡糖。這為魔芋甘露寡糖的酶法制備提供了更多選擇。