黑蒜對潰瘍性結腸炎BALB/c小鼠炎癥反應的影響

崔曉諭，鄭紅英，綦占文，林長青，吳笑天，郭建鵬,

（1.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002；3.延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林 延吉 133000；4.延邊大學融合學院，吉林 延吉 133002）

黑蒜又稱黑大蒜、發酵黑蒜，是將新鮮帶皮的大蒜經過酶解、熟化和干燥等過程制得[1]。大蒜既是普通食品又是傳統中藥材，作為藥材使用最早見于《名醫別錄》，《中國藥典》收載其功能為解毒、消腫、殺蟲、止痢。黑蒜中保留了大蒜原有的大部分成分，并提高了多種微量元素的含量[2]，具有抗菌譜廣、殺菌能力強的特點，同時兼具抗腫瘤、抗血小板凝集等多種藥理作用[3-4]。

潰瘍性結腸炎是炎癥性腸病的一種亞型，是一種影響結腸健康狀態的慢性特發性炎性疾病[5]。潰瘍性結腸炎患者多表現為大便充血和腹瀉，患者長期處于慢性炎癥狀態，導致腸道菌群失調或營養不良。研究表明，在全世界范圍內潰瘍性結腸炎的發病率正在增加，已成為一種全球性疾病[6-9]。

目前認為，促炎細胞因子和抗炎細胞因子平衡的失調是潰瘍性結腸炎發病的重要機制[10-11]。基于此，潰瘍性結腸炎的治療方法主要包括抗炎和免疫抑制，其主要目的是減輕炎癥反應和抑制免疫反應。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是公認的能介導潰瘍性結腸炎發病的促炎細胞因子，TNF-α的表達量可以作為反映潰瘍性結腸炎疾病嚴重程度的重要指標[12-14]。現階段，臨床治療潰瘍性結腸炎通常采用美沙拉秦和皮質類固醇等藥物，這些藥物因其免疫抑制和短期愈合的特性，具有較強的副作用，不適于長期使用。因此，尋求一種副作用小且安全、有效的天然替代品對于炎癥性腸病的防治具有重要意義。

此前，已有學者證明了黑蒜具有提高BALB/c小鼠免疫功能的作用[15]。本實驗通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型，考察黑蒜對小鼠炎癥評價指標的影響，為黑蒜在預防或輔助治療潰瘍性結腸炎中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級BALB/c雌性小鼠，6 周齡，體質量為18～21 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司。實驗動物生產許可證號SCXK（遼）2015-0001。

黑蒜 延邊韓工坊健康制品有限公司。

DSS（Lot：D5906810） 上海翊圣生物科技有限公司；美沙拉秦緩釋顆粒 上海愛的發制藥有限公司；米吐爾 上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸、過氧化氫溶液 天津市科密歐化學試劑有限公司；TNF-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、β-actin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠 武漢塞維爾生物科技有限公司；17590-1-AP TNF-α抗體 武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

臺式高速冷凍離心機 湖北平凡科技有限公司；Synergy HTX酶標儀 美國Bio-Tek儀器公司；Eclipse Ci顯微鏡（配備Digital Sight DS-FI2成像系統） 日本Nikon公司；TP-A2000電子天平 福建華志電子科技有限公司；BSA224S電子分析天平 德國Sartorius公司；BV-2垂直電泳儀、BT-2轉印電泳儀 武漢塞維爾生物科技有限公司；JY92-11N超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試物制備及灌胃劑量計算

黑蒜經水提取后，收集提取液，濃縮至料液比1∶1，作為受試物。按照中國成年男女平均體質量70 kg計，根據人體每日推薦劑量計算，設置低、中、高劑量進行動物灌胃實驗，分別為成人日攝入劑量的0.5、1、2 倍，計算后灌胃劑量分別為0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）。

1.3.2 實驗動物分組及造模

將36 只BALB/c小鼠適應性喂養7 d后，隨機分為6 組：正常組、模型組和黑蒜低、中、高劑量組以及陽性對照組，每組6 只。正常組小鼠正常飲用蒸餾水，其余各組小鼠自由飲水攝入質量分數4% DSS溶液，連續7 d，建立小鼠潰瘍性結腸炎模型。造模成功后，黑蒜低、中、高劑量組小鼠分別按0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）劑量灌胃黑蒜水提取液，陽性對照組小鼠按0.195 g/（kgmb·d）劑量灌胃美沙拉秦緩釋顆粒，正常組、模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。連續灌胃給藥10 d。

1.3.3 樣本采集

灌胃0～7 d期間，每天采集小鼠糞便留樣，進行隱血及血便檢測。最后一次灌胃24 h后，小鼠眼球取血，室溫下靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清分裝，-20 ℃保存待測。取小鼠結腸組織，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，測量結腸長度后放入裝有體積分數10%福爾馬林固定液的EP管中。

1.3.4 隱血及血便檢測

通過硫酸甲氨基酚法檢測血便。取少量小鼠糞便置于玻片中央，滴加10 mg/mL硫酸甲氨基酚-乙酸溶液3 滴，體積分數3%過氧化氫溶液3 滴，立即觀察結果[16]。

1.3.5 小鼠一般情況觀察及體質量、疾病活動指數測定

實驗全程觀察小鼠的精神及活動情況，記錄體質量并按下式計算體質量變化率。

參照Cooper等[17]的方法按表1所示評分標準計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分。

表1 小鼠DAI評分標準Table 1 Criteria for DAI evaluation of mice

1.3.6 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β質量濃度的測定

取一定量小鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，采用酶聯免疫吸附法測定TNF-α、IL-6、IL-1β質量濃度。

1.3.7 免疫印跡法檢測小鼠結腸組織中TNF-α表達水平

取小鼠結腸中遠端組織，用預冷磷酸鹽緩沖液沖洗后剪成小塊，加RIPA裂解液進行勻漿。勻漿完成后放置冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液，通過BCA法測定蛋白濃度。確定蛋白上樣量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉后，洗膜3 次分別加入TNF-α抗體（1∶1 000）和β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，洗膜3 次后加入二抗（1∶5 000），常溫孵育1 h，洗膜3 次后通過增強化學發光法顯色，進行曝光顯影可視化處理。

1.3.8 小鼠結腸病理組織觀察

最后一次灌胃24 h后，剖取結腸組織，常規取材，脫水，包埋，制片，蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察并描述組織病理學變化，拍攝主要描述中不同種類的病變部位。參照Bergstrom等[18]的方法進行病理組織學評分，評分標準見表2。

表2 小鼠病理組織學評分標準Table 2 Criteria for histopathological evaluation of mice

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 26軟件進行數據統計學分析，結果以平均值±標準差表示。多組間采用最小顯著性差異法比較，組間比較采用鄧肯檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。采用Graphad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠體質量、結腸長度及DAI評分的影響

圖1 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of black garlic on body mass of mice with ulcerative cditis

圖2 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響Fig.2 Effect of black garlic on colon length in mice with ulcerative colitis

圖3 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠DAI評分的影響Fig.3 Effect of black garlic on DAI score of mice with ulcerative colitis

小鼠造模后出現精神萎靡、毛發無光澤、血便、體質量下降等現象。由圖1可知，除正常組外，灌胃期間其余各組小鼠體質量呈不同程度下降，灌胃結束時，黑蒜各劑量組小鼠體質量與模型組差異顯著。由圖2可知，灌胃結束后，與正常組相比，模型組小鼠結腸長度極顯著縮短（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜中劑量組小鼠結腸長度顯著增加（P＜0.05），黑蒜高劑量組和陽性對照組小鼠結腸長度極顯著增加（P＜0.01），且接近于正常組長度。由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠DAI評分極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜低、高劑量組和陽性對照組小鼠DAI評分顯著降低（P＜0.05）。

2.2 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學變化的影響

圖4 灌胃黑蒜后潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學變化（×400）Fig.4 Histopathological changes in the colon of mice with ulcerative colitis after gavage with black garlic (× 400)

圖5 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠結腸病理組織學評分的影響Fig.5 Effect of black garlic on histopathological score of colon in mice with ulcerative colitis

由圖4可知，與正常組相比，模型組小鼠出現結腸黏膜炎癥，隱窩丟失，個別部位黏膜上皮明顯變薄，杯狀細胞減少。與模型組相比，黑蒜低劑量組小鼠結腸隱窩結構相對完整，仍有部分炎性細胞浸潤，無明顯差異。黑蒜中、高劑量及陽性對照組小鼠結腸隱窩結構基本完整，炎性浸潤較模型組小鼠明顯減輕，上皮細胞排列較為緊密，杯狀細胞數量較多，這與圖5黑蒜中、高劑量及陽性對照組小鼠病理組織學評分極顯著低于模型組（P＜0.01）的結果一致。

2.3 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠血清和結腸組織中TNF-α表達的影響

圖6 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠血清中TNF-α質量濃度的影響Fig.6 Effect of black garlic on TNF-α concentration in peripheral blood of mice

圖7 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中TNF-α相對表達量的影響Fig.7 Effect of black garlic on the relative expression of TNF-α in colon tissue of mice with ulcerative colitis

由圖6～7可知，模型組小鼠外周血中TNF-α質量濃度和結腸組織中TNF-α相對表達量極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜各劑量組和陽性對照組小鼠外周血中TNF-α質量濃度和結腸組織中TNF-α相對表達量均下降，并呈現量效關系趨勢，其中黑蒜中、高劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠IL-1β、IL-6表達的影響

由圖8～9可知，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6質量濃度極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜各劑量組和陽性對照組小鼠血清IL-1β、IL-6質量濃度均下降，并呈現量效關系趨勢，其中，黑蒜低劑量組顯著低于模型組（P＜0.05），黑蒜中、高劑量組與模型組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖8 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠血清IL-1β質量濃度的影響Fig.8 Effect of black garlic on serum IL-1β concentration in mice with ulcerative colitis

圖9 黑蒜對潰瘍性結腸炎小鼠血清IL-6質量濃度的影響Fig.9 Effect of black garlic on serum IL-6 concentration in mice with ulcerative colitis

3 討 論

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，性味辛、溫，具有消炎、抗菌、消毒等功效[4]。高溫發酵是大蒜的新型加工技術，發酵過程中發生美拉德反應，使蒜瓣通體呈黑色，故稱為黑蒜[19]。發酵過程促使生大蒜中部分蛋白質轉化成為氨基酸，容易被人體吸收。黑蒜對恢復體力、增強免疫力及保持健康具有積極作用，與生大蒜相比，黑蒜的抗氧化能力提高了數十倍，且食后無蒜味、味道酸甜，是極具潛力的保健食品原料[20-23]。

截至2015年，全球大約有1 120萬 人受到潰瘍性結腸炎與克羅恩病影響[24]。每年每10萬 人中有1～20 人新發，有5～500 人受到影響[25-26]。潰瘍性結腸炎是一種以T細胞浸潤結腸為特征的自身免疫性疾病，會導致結腸和直腸的炎癥和潰瘍，并可能導致一系列并發癥，其發病的直接原因尚不明確[27]。

DSS在誘導動物實驗性結腸炎中使用廣泛，成功率和重復性高，DSS誘導的動物結腸組織損傷與人潰瘍性結腸炎病變相似度高，是建立小鼠結腸炎模型的理想方法[28]。黏膜組織檢查是明確診斷潰瘍性結腸炎，并與克羅恩病相鑒別的主要方法。潰瘍性結腸炎的病理特征包括隱窩結構扭曲、隱窩發炎、隱窩膿腫以及固有層出血或出現炎性細胞。越來越多的證據表明，炎癥相關因素與潰瘍性結腸炎的發病機理密切相關。潰瘍性結腸炎發病時，全身性炎癥指標可能出現高水平表達，此時可以用血清炎癥標志物來量化炎癥的程度。目前已發現，黑蒜對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基均具有良好的清除作用，對脂多糖誘導的RAW264.7細胞生長抑制有顯著性保護作用[29]，對NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞炎性因子的釋放均有顯著抑制作用[30]。黑蒜中有效成分蒜氨酸通過抑制細胞外調節蛋白激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶/過氧化物酶體增殖因子活化受體γ刺激的核因子-κB/AP-1/信號轉導與轉錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）活化和p38誘導的STAT1活化，減輕DSS誘導的潰瘍性結腸炎，抑制脂多糖刺激的RAW264.7細胞的炎癥反應[31]。

本實驗采用DSS建立BALB/c小鼠潰瘍性結腸炎模型，造模后小鼠體質量降低，出現稀便和血便等癥狀。病理組織學可見結腸長度縮短、黏膜損傷、炎癥細胞浸潤等炎癥癥狀。以上結果提示DSS成功誘導了潰瘍性結腸炎模型。給予不同劑量黑蒜干預后，小鼠潰瘍性結腸炎癥狀減輕和病理組織學指標降低，TNF-α、IL-1β、IL-6的質量濃度顯著下降。結果表明，黑蒜具有降低BALB/c小鼠潰瘍性結腸炎炎癥反應的作用。研究結果為黑蒜在預防或輔助治療潰瘍性結腸炎中的應用提供了實驗依據。