硒化蒲公英多糖的制備、結構表征及益生菌促增殖活性

王麗波，高婧宇，李騰飛，李蓮玉，劉 博，張洪龑，楊 昱，徐雅琴

（東北農業大學文理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

微量元素硒（Se）對生命活動有重要的作用，具有抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫能力、保護視覺器官、延緩衰老、預防和治療心血管疾病等活性[1]。硒多糖是一類由硒和多糖結合而成的重要有機硒，相比無機硒，硒多糖的毒性更小，副作用更小[2]，且兼具多糖類生物活性，如抗氧化、降血脂、降血糖和抗炎活性等，能夠直接影響人體的生理功能。有研究報道，硒化修飾可改善多糖的生物活性：曾素娟等[3]對比了紅芪多糖和硒化紅芪多糖對口腔癌細胞SCC25增殖的抑制作用，結果表明各濃度多糖對SCC25細胞增殖的抑制作用均呈時間依賴性，且在相同條件下，硒化紅芪多糖對細胞增殖的抑制作用更強；Liu Xuegui等[4]研究了苜蓿中多糖和硒化多糖的抗氧化活性，結果表明，硒化多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除能力強于原多糖，在質量濃度為5.0 mg/mL時，硒化多糖對DPPH自由基的清除能力與VC相近，表明多糖經硒化修飾后具有更好的抗氧化活性。

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.）是一種藥食同源植物，有“天然抗生素”的美譽，含有多糖、萜類、酚酸、黃酮、香豆素等成分[5]。在上述化合物中，多糖是重要的功能性物質，已有研究表明蒲公英多糖具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗凝血等功效[6]。如Huang Dan等[7]研究了蒲公英多糖對DPPH自由基的清除能力，結果顯示，當質量濃度為1.4 mg/mL時，多糖對DPPH自由基的清除率最高，可達89.33%，半抑制質量濃度為0.51 mg/mL，表明蒲公英多糖具有較強的DPPH自由基清除活性；李雪石等[8]研究蒲公英多糖對鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠餐后血糖水平的影響，測定其血清胰島素水平、葡萄糖灌輸率、以及對α-糖苷酶體外活性的影響，結果表明蒲公英多糖具有降低餐后血糖的作用，且作用機制研究表明，蒲公英多糖可抑制小腸對麥芽糖的水解和對葡萄糖的吸收。目前，對蒲公英多糖的相關研究尚處于初級階段，鮮見有關蒲公英多糖硒化修飾的研究報道。

本實驗以蒲公英根為原料，采用硝酸-亞硒酸鈉法制備硒化蒲公英多糖（selenized dandelion root polysaccharide，Se-DRP）。利用高效液相色譜、氣相色譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等多種方法表征多糖結構，測定Se-DRP對益生菌增殖的促進作用以及對α-淀粉酶活性的抑制作用。旨在通過對Se-DRP結構和活性的研究，探索蒲公英多糖的新應用領域，為硒化多糖的深入研究及蒲公英資源開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根購自黑龍江省哈爾濱市藥材店，磨成粉后封袋密封保存，備用。

纖維素酶（≥50 U/g） 北京奧博興生物科技有限公司；硝酸、亞硒酸鈉、葡聚糖標準品、甲醇、三氟乙酸、吡啶、醋酸酐、氯仿、冰醋酸（色譜純） 美國Sigma公司；植物乳桿菌10665、嗜酸乳桿菌 東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室；大孔吸附樹脂D101、Sephadex G-100 南開大學化工廠；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LC-AFS6500型液相色譜原子熒光聯用儀 北京海光儀器有限公司；WFJ-7200型可見分光光度計、UV-2700雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；ALPHA-T型傅里葉變換紅外光譜儀、AVANCEIII 400兆NMR波譜儀 德國Bruker公司；2695/2414高效液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；GC-2010 plus氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蒲公英多糖的制備與純化

采用超聲輔助酶法，以去離子水為提取劑，料液比1∶30（m/V）、超聲功率700 W、超聲時間40 min、纖維素酶添加量0.8%（以蒲公英質量計）的條件下提取多糖。提取液經過濾、濃縮、體積分數80%乙醇醇沉、凍干后得到蒲公英粗多糖。

依次采用D101大孔吸附樹脂（3.5 cm×50 cm）和Sephadex G-100（1.8 cm×40 cm）純化蒲公英粗多糖。先后兩次洗脫條件分別為：1）D101大孔吸附樹脂：多糖上樣量為40 mg，去離子水為洗脫劑，洗脫流速2 mL/min；2）Sephadex G-100：多糖上樣質量濃度1.0 mg/mL，去離子水為洗脫劑，洗脫流速0.6 mL/min。采用苯酚硫酸法[9]跟蹤檢測洗脫液，將多糖洗脫峰合并，濃縮、凍干后得到純化蒲公英多糖。

1.3.2 Se-DRP的制備

用50 mL體積分數為0.5%的HNO3溶液溶解蒲公英多糖（500 mg），在室溫下攪拌30 min，加入0.5 g Na2SeO3和0.7 g BaCl2，將混合物在60 ℃下攪拌，反應4 h。冷卻至室溫后，滴加1 mol/L的NaOH溶液將pH值調節至7～8。加入0.5 g Na2SO4除去Ba2+，將反應物3 500 r/min離心5 min，取上清液，用流水透析至加入抗壞血酸不顯紅色，再用去離子水透析12 h，濃縮、凍干即得到Se-DRP。

1.3.3 Se-DRP的理化性質測定

1.3.3.1 成分測定

采用原子熒光光譜法測定硒含量[10]，苯酚硫酸法測定多糖質量分數[9]，2,4-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[11]，考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[12]，間羥基聯苯法測定糖醛酸含量[13]。

1.3.3.2 分子質量測定

配制質量濃度為2.0 mg/mL的葡聚糖標準品溶液（3 000、5 000、10 000、40 000、70 000 Da）和Se-DRP溶液，過0.22 μm的微孔濾膜后采用高效液相色譜儀測定分子質量。

色譜條件：檢測器：2414示差折光檢測器；色譜柱：Ultrahydrogel Linear色譜柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱溫：（35±0.1）℃；流動相：超純水；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.3.3 單糖組成測定

稱取20.0 mg Se-DRP于具塞試管中，加入4.0 mL 4 mol/L的三氟乙酸，密封振蕩5 min，在110 ℃條件下水解8 h。反應結束后，加入4 mL色譜級甲醇輔助氮吹，除盡三氟乙酸。按照參考文獻[14]，將單糖標準品和多糖水解物用糖腈乙酰化法衍生處理后，利用氣相色譜儀分析單糖組成。

1.3.4 Se-DRP的結構測定

1.3.4.1 紫外光譜分析

配制質量濃度為0.1 mg/mL的Se-DRP溶液，在200～400 nm的波長范圍內掃描。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取2.0 mg Se-DRP樣品與KBr固體充分研磨后壓片，在4 000～400 cm－1的波數范圍內掃描。

1.3.4.3 NMR分析

將70.0 mg Se-DRP樣品溶于1 mL的D2O，充分振蕩核磁管使其完全溶解，室溫下采用400 MHz NMR儀測定1D-NMR（1H-NMR、13C-NMR）。

1.3.5 Se-DRP對益生菌增殖作用分析

1.3.5.1 培養基的配制

MRS肉湯培養基的配制：1 L去離子水中加入10.0 g蛋白胨、10.0 g牛肉膏、5.0 g酵母粉、1.0 mL吐溫-80、2.0 g K2HPO4、5.0 g乙酸鈉、2.0 g檸檬酸二銨、0.20 g MgSO4、0.05 g MnSO4，調節pH值至6.5（±0.05）。

MRS固體培養基的配制：將15.0 g瓊脂加入到MRS肉湯培養基中，制得MRS固體培養基。

增殖培養基的配制：在MRS肉湯培養基中分別添加不同質量濃度（0、5、10、15、20 mg/mL）的Se-DRP，以不含碳源的MRS肉湯培養基為空白對照，低聚果糖（fructo oligosaccharide，FOS）為陽性對照。

1.3.5.2 菌種的活化

將MRS液體培養基用高壓滅菌鍋滅菌（120 ℃、15 min）。無菌環境下將植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌分別接種于MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養箱中培養36 h后，將兩個菌株分別接種于MRS固體培養基上，37 ℃恒溫培養36 h后，分別挑選兩個菌種的單個菌落接種于MRS液體培養基中，同樣條件再培養36 h，得到活化菌種。

1.3.5.3 Se-DRP對植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌增殖作用分析

將10 mL不含碳源的MRS液體培養基高壓滅菌。用無菌水溶解Se-DRP和FOS，過0.22 μm微孔濾膜后分別加入到MRS液體培養基中，使糖的終質量濃度為0、5、10、15、20 mg/mL。無菌環境下接種已活化的實驗菌種，37 ℃恒溫培養箱培養48 h，測定培養液在600 nm波長處的光密度值（OD600nm）。

1.3.5.4 益生菌生長曲線的繪制

取干凈無菌的試管若干，各加入10 mL不含碳源的MRS肉湯培養基，滅菌。將200 mg Se-DRP和FOS樣品用少量無菌水溶解后，過0.22 μm濾膜，無菌條件下分別加入到滅菌的MRS肉湯培養基中，使糖的終質量濃度為20 mg/mL。無菌條件下分別接種活化的植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌，37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。分別在培養的0、4、8、16、24、32、40、48 h取樣，測定液體培養基pH值和600 nm波長處的光密度值（OD600nm），并繪制生長曲線。

1.3.6 Se-DRP對α-淀粉酶活性抑制率的測定

取1.0 mL多糖溶液（質量濃度0.2～4.0 mg/mL）與1.0 mLα-淀粉酶溶液（質量濃度0.6 mg/mL）和可溶性淀粉溶液（質量濃度2.0 mg/mL）充分混合，37 ℃恒溫培養箱中反應20 min，結束后，加入5.0 mL的二硝基水楊酸試劑沸水浴5 min，冷卻至室溫，采用紫外-可見分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對照，按下式計算抑制率[15]。

式中：Ae為樣品、底物和酶的吸光度；Af為樣品和底物的吸光度；Ag為酶和底物的吸光度；Ai為底物的吸光度。

1.4 數據處理與分析

實驗數據均以3 次結果的平均值±標準誤差表示。采用Origin 8.5軟件繪圖，并用SPSS軟件進行差異顯著性分析，差異顯著性分析方法為鄧肯檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Se-DRP的理化性質

經兩步柱層析分離后制得的純化蒲公英多糖的質量分數為（94.24±0.48）%。Se-DRP的質量分數為（93.47±0.75）%，可知硒化修飾后多糖純度基本沒有變化。成分測定結果表明，Se-DRP中的硒含量為（190.00±0.43）μg/g，糖醛酸含量為（103.80±0.05）mg/g，還原糖含量為（1.40±0.02）mg/g，不含蛋白質。

Se-DRP的分子質量采用高效液相色譜測定（圖1A），Se-DRP的洗脫曲線僅為一個尖銳對稱峰，表明其分子質量分布范圍較窄，為均一多糖。根據標準葡聚糖回歸方程lgm＝-0.624 4x+13.362（R2＝0.992 8），代入Se-DRP保留時間15.14 min，得到Se-DRP的分子質量為8 102 Da。Se-DRP的單糖組成由氣相色譜測定（圖1B），相同條件下通過對比標準品單糖出峰時間可確定單糖種類。結果表明，Se-DRP由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成，物質的量比為0.64∶0.73∶19.36∶0.84∶1.00∶27.41。

圖1 Se-DRP液相色譜（A）和氣相色譜（B）圖Fig.1 Liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of Se-DRP

2.2 Se-DRP結構

2.2.1 紫外光譜分析

由圖2A可知，Se-DRP在260 nm和280 nm波長處均沒有吸收峰，表明Se-DRP中不存在蛋白質和核酸等成分。

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜是分析多糖結構有利的工具，可根據多糖的特征吸收峰鑒定多糖的結構。Se-DRP的傅里葉變換紅外光譜見圖2B，3 389.51、2 936.71 cm-1波長處對應的吸收峰分別是由O—H、C—H的伸縮振動引起的[16]，1 745.46 cm-1波長處的吸收峰是由C＝O的伸縮振動引起的，1 608.33 cm-1波長處的吸收峰是由羧酸中C＝O伸縮振動引起的[17-18]，1 424.08 cm-1波長處的吸收峰是C—H的彎曲振動峰[19]，1 251.24 cm-1波長處的吸收峰是C—O糖苷鍵的振動峰，1 106.98 cm-1和1 026.99 cm-1之間的吸收峰表明有吡喃糖存在，834.16 cm-1波長處的吸收峰表明多糖結構中有α-糖苷鍵[20]，759.89 cm-1和638.48 cm-1處的峰歸因于Se＝O的不對稱伸縮振動[19,21]。

圖2 Se-DRP的紫外光譜圖（A）和傅里葉變換紅外光譜圖（B）Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Se-DRP

2.2.3 NMR分析

多糖結構中的糖殘基數目、糖環構型、異頭構型、連接位置等信息可通過NMR分析獲得。1H-NMR和13C-NMR譜圖中多糖的典型信號分別集中在δH3.0～5.5和δC60～110范圍內，根據δH4.0～5.5異頭質子和δC90～110異頭碳的共振信號，可判斷多糖的異頭構型（α-、β-構型）和糖環構型（吡喃糖和呋喃糖）。一般來說，α-構型異頭氫質子的δ大于5.0，而β-構型異頭氫質子的δ小于5.0；呋喃糖的C2和C4在δ82～84間有信號，吡喃糖C3和C5的δ一般小于80[22]。

由圖3A可知，Se-DRP在異頭氫的共振區域范圍內共有6 個信號峰，δ分別為4.40、4.56、4.90、5.03、5.18、5.37，確定為3 個α-構型異頭氫質子和3 個β-構型異頭氫質子[22]。同時在13C NMR譜圖（圖3B）中，在異頭碳的共振區域范圍內，對應有6 個信號峰，δ分別為99.54、100.41、103.23、103.68、107.43、109.25。結合譜圖及文獻[17,23-24]，將δ進行歸屬，確定組成Se-DRP的主要糖殘基有→6)-β-D-葡萄糖-(1→（H1/C1～H6/C6位移值分別為4.40/103.23、3.43/69.90、3.63/74.29、4.01/70.57、3.95/76.98、3.67/67.94）、→3)-β-D-半乳糖-(1→（H1/C1～H6/C6化學位移分別為4.56/103.68、3.46/69.90、3.66/79.03、3.43/72.61、3.63/74.29、3.72/61.27）、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→（H1/C1～H5/C5化學位移分別為5.03/109.25、4.16/81.35、3.87/76.58、4.07/83.85、3.67/68.47）和→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→（H1/C1～H5/C5化學位移分別為5.37/99.54、3.63/71.41、3.85/73.70、3.74/79.03、4.17/70.57，C6為170.78）。根據文獻[25-26]，δ4.90/107.43和δ5.18/100.41分別歸屬于β-甘露糖和α-鼠李糖。

圖3 Se-DRP的1D NMR譜Fig.3 1D NMR spectra of Se-DRP

2.3 Se-DRP對益生菌增殖的促進作用

益生菌是腸道中一類對宿主有益，通過維持宿主腸道微生態平衡，從而對宿主產生確切健康功效的微生物總稱。雙歧桿菌和乳桿菌是兩類主要益生菌，約占腸道細菌總數的25%，包括長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌10665等[27-28]。研究表明，益生菌有預防和治療腸道疾病、刺激免疫功能、降低膽固醇和心血管病風險、抗腫瘤、抗癌及抑制病原菌的作用[29]。益生元是一種刺激細菌生長的化合物，它與機體的健康有關，能夠降低由微生物區系改變介導的疾病風險[30]。目前，FOS是公認的最有利于益生菌增殖的碳源[31]，對乳桿菌等益生菌具有較好的增殖促進作用。如王鑫[32]以FOS為陽性對照，研究了菜籽多糖及其修飾產物對嗜酸乳桿菌的益生作用，結果表明FOS及多糖均具有一定的增殖促進作用，且FOS的作用更強。Huang Fei等[33]研究了發酵前后龍眼果肉多糖對植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的益生活性，發現發酵后多糖弱于陽性對照FOS對菌種的促增殖活性。因此，本實驗采用FOS作陽性對照，研究Se-DRP對植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的促生長作用。

2.3.1 Se-DRP對益生菌的促生長作用

培養液的光密度值（OD600nm）可以衡量菌體數量變化，OD600nm越大，表示菌液中所含有的菌體數目越多。由圖4A、B可知，在多糖質量濃度5～20 mg/mL范圍內，植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的數量都隨Se-DRP質量濃度的增加而增加，表明Se-DRP對兩個菌種均有一定的增殖促進作用，且菌種的增殖和Se-DRP質量濃度之間呈劑量依賴性。當質量濃度到達15 mg/mL后，菌種數量增長趨勢相對變緩。此外，相同條件下，Se-DRP對兩個菌種的促生長作用均弱于FOS。

圖4 Se-DRP對植物乳桿菌10665（A）和嗜酸乳桿菌（B）的促增殖活性Fig.4 Effect of Se-DRP on promoting the proliferation of Lactobacillus plantarum 10665 (A) and Lactobacillus acidophilus (B)

2.3.2 益生菌的生長曲線

多糖作為碳源在被益生菌代謝利用的過程中，會被分解為一些單糖，而這些單糖可作為益生元提供能源物質，促進益生菌的生長。同時，益生菌利用多糖代謝會產生有機酸，營造酸性環境，并且隨著培養時間的延長，菌體產生的酸不斷增加，培養液的pH值也下降。所以通過測定培養液中pH值的變化，可掌握菌體的增殖狀況[34]。

由圖5A、B可知，隨著培養時間的延長，接種植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的Se-DRP和FOS液體培養基OD600nm均明顯上升，在培養36 h后，OD600nm基本維持穩定，說明菌落總數隨培養時間的延長不斷增加，在培養36 h后，菌種的生長趨于穩定。Se-DRP對益生菌增殖的促進作用可能與其低分子質量關系較大。王霄[35]對比了菜籽多糖及其酶解產物對益生菌的增殖促進作用，研究結果表明，酶解后分子質量為7 184 Da的多糖對益生菌生長促進作用強于酶解前分子質量為52 485 Da的多糖，表明低分子質量的多糖可被益生菌更好地利用[36]。

從培養液pH值與培養時間的關系曲線可知，隨著培養時間的延長，植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌在Se-DRP培養基和FOS培養基中的pH值均呈下降趨勢，在培養36 h后，pH值趨于穩定。這是因為益生菌生長過程中分泌的糖苷酶能夠將多糖水解成單體，然后通過代謝將單體降解成短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸和乳酸）和氣體，從而導致發酵液的pH值明顯降低。但隨著培養時間延長，培養基中的碳源基本被消耗，所以益生菌的生長變緩，發酵液的pH值也趨于穩定[37]。

綜上，Se-DRP對植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌具有良好的增殖促進作用，可視為潛在的益生元。

圖5 植物乳桿菌10665（A）和嗜酸乳桿菌（B）的生長曲線Fig.5 Growth and acid production curves of Lactobacillus plantarum 10665 (A)and Lactobacillus acidophilus (B) in the presence and absence of Se-DRP

2.4 Se-DRP對α-淀粉酶活性的抑制作用

α-淀粉酶抑制劑通過抑制小腸中糖類水解酶的活性，減少淀粉類食物中葡萄糖的釋放，延緩碳水化合物的吸收。因此，天然的α-淀粉酶抑制劑可作為口服降糖藥。如圖6所示，在質量濃度0～1.0 mg/mL范圍內，Se-DRP和阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制率均隨質量濃度的增加而增加，當質量濃度為1.0 mg/mL時，Se-DRP和阿卡波糖對α-淀粉酶活性的抑制率分別為（48.34±0.96）%和（77.47±1.07）%。隨后二者對α-淀粉酶活性的抑制率保持平穩。在質量濃度為4.0 mg/mL時，Se-DRP的抑制率為（52.34±1.45）%，低于阿卡波糖的抑制率（（79.94±1.24）%）。這是由于多糖在低質量濃度時，酶過量，每個多糖分子都可以和酶分子結合，抑制酶的活性，當濃度達到一定值時，所有的酶分子都已和多糖結合，再增加多糖的質量濃度，抑制率不再明顯升高[38]。

萬艷娟等[39]報道了質量濃度2.00 mg/mL的南瓜多糖對α-淀粉酶活性的抑制率為2.50%。王文武等[38]研究了海藻多糖對α-淀粉酶活性的抑制作用，結果顯示，隨著多糖質量濃度的增加，其活性抑制率也不斷提高，當多糖質量濃度達到10.00 mg/mL時，其對α-淀粉酶活性的抑制率不再增加，半抑制質量濃度為2.85 mg/mL。可見Se-DRP對α-淀粉酶活性的抑制作用強于南瓜多糖和海藻多糖，可應用于碳水化合物消化調節、食品升糖指數控制。

圖6 Se-DRP對α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of Se-DRP on α-amylase activity

3 結 論

本實驗制備了硒含量為（190.00±0.43）μg/g的Se-DRP，其質量分數為（93.47±0.75）%，由6 種單糖組成，分子質量8 102 Da。Se-DRP具有多糖特征吸收峰，主要糖殘基為→6)-β-D-葡萄糖-(1→、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→、→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→和→3)-β-D-半乳糖-(1→。在Se-DRP質量濃度為5～20 mg/mL范圍內，隨多糖Se-DRP質量濃度的增加，對植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的生長促進作用顯著增強，同時產生酸性代謝產物，說明Se-DRP可被益生菌利用，是潛在的低分子質量多糖類益生元。在質量濃度為0～1.0 mg/mL范圍內，Se-DRP對α-淀粉酶活性的抑制率和質量濃度之間呈劑量依賴性，質量濃度為1.0 mg/mL時，Se-DRP的抑制率可達（48.34±0.96）%，表明Se-DRP可作為天然的α-淀粉酶抑制劑應用于降血糖藥物或功能性食品。