苯乳酸對熒光假單胞菌基于細胞膜損傷和DNA破壞的雙靶位抑菌機制

寧亞維，侯琳琳，李明蕊，楊 正，馬夢戈，王志新，王世杰，賈英民

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

快節奏的現代化生活方式導致市場上冷藏即食類食品數量增多，由此伴隨產生的因嗜冷菌污染引起的食品腐敗變質與安全問題也日益增多。假單胞菌是一類典型的嗜冷菌，可導致肉制品和乳制品等多種冷藏食品發生腐敗變質。如2010年和2011年分別在北京和長沙的肉產品市場中發現“發光豬肉”[1]，該豬肉由于熒光假單胞菌污染而產生發光現象。熒光假單胞菌會分泌蛋白酶導致肉產生黏液，極大降低了加工肉制品的品質和安全性[2]。另外，熒光假單胞菌也是乳制品中常見的嗜冷菌[3]，分泌的堿性蛋白酶可以分解酪蛋白，導致乳蛋白凝固以及乳清析出，使牛乳產生苦味，造成乳制品品質顯著下降[4]。熒光假單胞菌甚至可以在食品加工設備和管道中以生物膜形式存在，增強了嗜冷菌對加熱、消毒等傳統殺菌方式的耐受能力[5]。熒光假單胞菌除導致食品腐敗變質外，還會引起諸如敗血癥、感染性休克以及血管內凝血等疾病[6]。因此，控制熒光假單胞菌的生長對提高食品安全性以及延長食品貨架期具有重要意義。

添加防腐劑是延長食品貨架期最為常用的手段之一，目前所用的防腐劑以化學防腐劑為主，然而化學防腐劑存在安全性低、生產過程易于造成環境污染等問題。隨著人們對食品安全的日漸重視，生物防腐劑因具有來源天然、安全性高等優勢而受到青睞[7]。苯乳酸即2-羥基-3-苯基丙酸，是近年來發現的一種新型天然有機酸類抑菌物質，可由乳酸菌等微生物代謝產生，天然存在于泡菜、酸面團等乳酸菌發酵食品中[8]。苯乳酸具有廣譜抑菌性，可以有效抑制食源性腐敗菌和致病菌；研究發現苯乳酸還具有激活免疫等生理功能[9]，因此苯乳酸在食品防腐方面具有替代苯甲酸的潛在優勢[10]。苯乳酸的抑菌機制近年來受到學者們的關注，但相關研究主要集中于食源性致病菌，如，Dieuleveux等[11]研究了苯乳酸對單細胞增生李斯特菌的抑菌機制，提出了細胞壁是苯乳酸的抑菌靶位；Wang Fengting等[12]考察了苯乳酸對糞腸球菌的抑菌機制，提出了細胞膜損傷和胞內成分滲漏有關的抑菌機制；劉韻昕[7]研究了苯乳酸對枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理，發現苯乳酸可以破壞菌體細胞壁和細胞膜的完整性，同時干擾或阻斷蛋白質、DNA的正常合成。Liu Fang等[13-14]分析了苯乳酸對陰溝腸桿菌的作用方式，發現苯乳酸通過破壞陰溝腸桿菌的胞質膜，從而抑制陰溝腸桿菌的生長。本課題組基于多年來對苯乳酸的研究，發現苯乳酸對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有不同的抑菌機制，如苯乳酸可以破壞單細胞增生李斯特菌細胞膜完整性，但對大腸桿菌的細菌膜僅破壞其滲透性，而對其完整性無顯著性損傷[15]。上述各項研究主要集中于苯乳酸對食源性致病菌的抑制方面，且研究結果顯示苯乳酸對不同指示菌的作用機制因菌株特性不同而有差異。然而，苯乳酸作為一種處于開發階段的新型抑菌物質，有必要全面了解其抑菌機制，為進一步工業化應用提供充分的科學依據。因此，本研究通過考察苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜（包括跨膜電位、膜完整性與滲透性、菌體超微結構等方面）、蛋白質及DNA多靶位的抑制作用，闡釋苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌機制，以期為冷藏食品中嗜冷菌-熒光假單胞菌的控制以及苯乳酸在食品中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescensATCC13525）由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。

D-苯乳酸（純度98%）、鉀離子熒光探針（PBFI acetoxymethyl ester，PBFI AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）探針、DiSC3(5)探針 美國Sigma公司；LIVE/DEADTM探針 美國Thermo Fisher公司；Minibest Bacterial genomic DNA Extraction Kit ver 3.0 大連寶生物有限公司；低分子質量蛋白質Marker、DNA Ladder北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Scientific公司；Accuri C6 plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；F-7000熒光分光光度計、S-4800-I掃描電子顯微鏡 日本日立公司；170-4405EDU凝膠電泳儀、Gel DocTMXR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；脫色搖床TS-2000A 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SpectraMax Plus 384酶標儀 美國分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度的測定

根據Melleg?rd等[16]的方法并略作修改，采用微量二倍稀釋法利用96 孔板來測定苯乳酸對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。用新鮮的營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基培養熒光假單胞菌至對數期，調整其細菌濃度為106CFU/mL備用。在96 孔板上第1列加200 μL的20 mg/mL苯乳酸溶液，第2～11列加入100 μL的NB培養基，從第1列吸取100 μL的苯乳酸溶液加入到第2列，吸打混勻后取100 μL加到第3列，依次重復至第10列再吸出100 μL棄掉。第11列不加苯乳酸作為陽性對照，第12列加入200 μL的NB培養基作為陰性對照，然后分別在第1～11列中加入100 μL的106CFU/mL菌懸液。在30 ℃的恒溫培養箱中培養18～24 h，通過酶標儀測定吸光度，參考陰性對照，以細菌被抑制的最低苯乳酸質量濃度為MIC。

1.3.2 時間-抑菌曲線繪制

將培養至對數期的熒光假單胞菌接種到NB培養基中，調菌液濃度為106CFU/mL。將菌懸液與不同質量濃度的苯乳酸（0（空白對照組）、1/2 MIC、MIC、2 MIC）等體積混合，于30 ℃恒溫培養箱中分別培養0、2、4、6、8、12、24 h后取樣，并采用稀釋涂布平板法測定菌液中的熒光假單胞菌的活菌數。以時間為橫坐標，活菌數的對數值為縱坐標來繪制時間-抑菌曲線。

1.3.3 細胞膜跨膜電位的測定

使用熒光探針DiSC3(5)對熒光假單胞菌細胞的膜電位進行測定，根據Sun Zhilan等[17]的方法并略作修改，將培養至對數期的熒光假單胞菌用5 mmol/L Hepes緩沖液（含有10 mmol/L葡萄糖，pH 7.2）清洗重懸，調節菌懸液濃度至2×108CFU/mL。向菌懸液中加入DiSC3(5)探針（終濃度為1 μmol/L），于30 ℃黑暗條件下孵育20 min，然后加入KCl溶液（終濃度為0.1 mol/L）平衡細胞質內外K+濃度。上述含K+的Hepes菌混合液與苯乳酸等體積混合，使苯乳酸終質量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC。分別加入尼日利亞菌素作為陰性對照，加入纈氨霉素作為陽性對照。用F-7000熒光分光光度計分別在激發波長λex＝650 nm、發射波長λem＝672 nm的條件下測定熒光強度。

1.3.4 細胞膜滲透性的測定

采用鉀離子敏感性探針PBFI AM考察鉀離子的泄漏情況。根據Herranz等[18]的方法，首先制備熒光假單胞菌對數期的細胞，用含5 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液清洗重懸，調整菌懸液濃度為2×108CFU/mL。將PBFI AM加入到菌懸液（終濃度為2 μmol/L）中。將上述菌懸液與終質量濃度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）等體積混合作用0.5 h。采用熒光分光光度計分別在λex＝346 nm、λem＝505 nm條件下測定熒光強度，進行3 次平行實驗。

1.3.5 細胞膜完整性的測定

取對數期的熒光假單胞菌離心，質量分數0.85%生理鹽水清洗重懸至菌懸液濃度為2×108CFU/mL，菌懸液與不同質量濃度苯乳酸等體積混合，使苯乳酸終質量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC。30 ℃恒溫作用0.5 h后用質量分數0.85%生理鹽水清洗重懸，加入PI、SYTO-9（終濃度均為1 μmol/L），30 ℃避光孵育20 min后，再用質量分數0.85%生理鹽水清洗重懸，用流式細胞儀檢測。將上述菌懸液離心后棄掉上清液，取菌體進行顯微鏡觀察。

1.3.6 細胞超微結構觀察

取對數期的熒光假單胞菌離心，用質量分數0.85%生理鹽水清洗重懸制備為2×108CFU/mL的菌懸液。然后按Kang Shimo等[5]的方法進行制樣，菌懸液中加入苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC），在30 ℃培養箱中作用1 h后，采用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，用體積分數2.5%戊二醛溶液固定過夜，經0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗3 次后，依次用體積分數30%、50%、70%、85%和90%乙醇溶液脫水，無水乙醇洗脫兩次（15 min/次）。乙酸異戊酯置換乙醇兩次（20 min/次）自然晾干除去有機溶劑。取菌體噴金后用掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀結構。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析菌體蛋白質

取對數期的熒光假單胞菌離心，用質量分數0.85%生理鹽水清洗重懸制備4×108CFU/mL的菌懸液。參考Lin Lin等[19]的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）方法，將菌懸液加入終質量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC苯乳酸。30 ℃恒溫培養箱中靜置作用1 h后，離心清洗收集菌體。菌懸液與4×蛋白上樣緩沖液混合，至100 ℃沸水中煮沸5 min后離心。取上清液上樣進行SDS-PAGE，初始電壓為80 V，樣品進入分離膠后，將電壓調至120 V，直至溴酚藍電泳至膠底。染色液染色30 min后，再用脫色液脫色直至蛋白條帶清晰，使用凝膠成像系統拍照并分析。

1.3.8 基因組DNA分析

收集對數期的熒光假單胞菌，用質量分數0.85%生理鹽水清洗、重懸，制備4×108CFU/mL菌懸液。體外DNA作用方法：按照Takara試劑盒方法提取基因組DNA，與苯乳酸等體積混合使其終質量濃度分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC，30 ℃恒溫培養箱作用1 h；體內DNA作用方法：菌懸液與不同濃度苯乳酸等體積混合，30 ℃恒溫培養箱作用1 h后，按照Takara試劑盒方法提取基因組DNA。用超微量紫外分光光度計測定DNA純度（OD260nm/OD280nm＝1.87）以及DNA質量濃度（40 μg/mL），進行DNA瓊脂糖凝膠電泳（100 V、60 min），凝膠成像系統拍照并分析。使用熒光分光光度計在激發波長280 nm、發射波長300～500 nm條件下對體外、體內DNA熒光強度進行檢測。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3 次取其平均值，通過SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌活性

苯乳酸對熒光假單胞菌的MIC為1.25 mg/mL，顯著低于Kang Shimo等[5]研究的乳糖醛酸對熒光假單胞菌的MIC（12.5 mg/mL）。通過時間-抑菌曲線進一步研究苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌效果。由圖1可知，空白對照組的熒光假單胞菌生長狀況良好，1/2 MIC苯乳酸組熒光假單胞菌數在前4 h輕微下降，但是4 h后隨時間延長而增加，12 h后趨于穩定，與空白對照組相差0.56 lg（CFU/mL）。而MIC、2 MIC苯乳酸組在2 h菌落數出現明顯下降，6 h后活菌數趨于穩定，作用24 h后活菌數分別降低了1.79、3.94 lg（CFU/mL），2 MIC苯乳酸抑制效果明顯優于MIC苯乳酸。實驗結果表明1.25 mg/mL苯乳酸可以有效抑制熒光假單胞菌的生長繁殖，并且隨苯乳酸質量濃度增大抑制效果增強。這與本課題組研究的MIC（1.25 mg/mL）苯乳酸作用于大腸桿菌24 h后活菌數降低將近1 lg（CFU/mL）的抑菌效果[15]相比，苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌效果更加顯著。

圖1 苯乳酸對熒光假單胞菌的時間-抑菌曲線Fig.1 Time-inhibition curves of PLA against P.fluoresceins

2.2 苯乳酸對熒光假單胞菌跨膜電位的影響

跨膜電位是指質子通量引起的電化學梯度在細胞膜上產生的電位差[20]，DiSC3(5)是一種親脂性的熒光探針，進入正常細胞后會在細胞脂質層發生自我猝滅。然而當細胞膜去極化時，DiSC3(5)會從細胞膜內釋放出來，導致熒光信號增加[21]。纈氨霉素作為脂溶性抗生素可以有效破壞細胞膜上的跨膜電位[22]，而尼日利亞菌素對跨膜電位并無作用。如圖2所示，隨時間的延長，未添加苯乳酸組的DiSC3(5)熒光強度穩定在170左右，1/2 MIC、MIC、2 MIC的苯乳酸作用后終熒光強度分別達到319.9、345.7、371.1，均高于纈氨霉素處理組，隨著苯乳酸質量濃度的增加，DiSC3(5)熒光強度增大。結果表明苯乳酸可以使DiSC3(5)熒光強度增加，且增加程度呈劑量依賴性，導致細胞膜去極化。不同有機酸處理的細菌均呈現細胞膜去極化[23]。據報道，在細胞膜去極化后，抗菌物質很容易插入細胞膜，導致細胞膜形成孔隙，從而導致鉀離子等必需離子的泄漏[24]。Liu Guorong等[25]研究表明雙歧桿菌素A與纈氨霉素的作用效果一致，能使大腸桿菌的胞質膜快速完全去極化。說明苯乳酸與雙歧桿菌素A均可以導致跨膜電位消散，使細胞膜去極化。

圖2 苯乳酸對熒光假單胞菌跨膜電位的影響Fig.2 Effect of PLA on the transmembrane potential of P.fluoresceins

2.3 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜滲透性的影響

圖3 苯乳酸對熒光假單胞菌鉀離子泄露的影響Fig.3 Effect of PLA on potassium ion leakage from P.fluorescens

鉀離子通道屬于橫跨細胞膜的離子選擇性孔道，用來調控和產生膜電位。通過膜不滲透性的PBFI AM考察苯乳酸對熒光假單胞菌細胞內鉀離子泄漏的影響。如圖3所示，經過不同質量濃度苯乳酸作用熒光假單胞菌0.5 h后，鉀離子泄露量與對照組相比均高度顯著增加（P＜0.001）。說明苯乳酸可以增大熒光假單胞菌細胞膜的通透性，導致鉀離子的泄露，并且泄漏量與苯乳酸質量濃度呈正相關。這與周倩倩等[26]研究的丁香酚對熒光假單胞菌的作用效果相似，其均會通過破壞細胞膜滲透性，導致鉀離子泄露。與2.2節細胞膜電位的變化相對應，苯乳酸破壞膜電勢后導致細胞膜去極化，使平衡膜電位的鉀離子發生泄漏，進一步驗證了苯乳酸通過破壞熒光假單胞菌的跨膜電位，增加細胞膜的滲透性。

2.4 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜完整性的影響

通過SYTO-9和PI雙染法標記細胞，采用熒光顯微鏡觀察分析苯乳酸對菌體細胞膜的損傷情況。SYTO-9能夠進入細胞膜完整的細胞內將核酸染色發出綠色熒光。PI可以透過破損細胞膜，而使核酸染色發出紅色熒光[27]。當細胞膜受損，PI可進入到細胞，對核酸進行染色，發出紅色熒光，SYTO-9也能進入細胞染色，但是PI的沾染能力強于SYTO-9，此時會產生熒光信號的疊加，即紅色和綠色的疊加，呈現紅色、橙色或黃色[22]。苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜完整性的影響如圖4所示，空白對照組呈綠色菌體，說明細胞膜完整；1/2 MIC苯乳酸組呈綠色、黃色和橙黃色，說明部分細胞膜有輕微破損；MIC苯乳酸組呈現橙黃色，說明大部分的細胞膜破損；2 MIC苯乳酸處理組呈現橙紅和紅色，說明2 MIC苯乳酸對膜的破壞程度明顯強于MIC苯乳酸。上述結果表明隨著苯乳酸質量濃度增加，熒光假單胞菌細胞膜損傷程度增大。

圖4 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜完整性的熒光顯微鏡圖Fig.4 Fluorescence microscopic images of membrane integrity of PLA-treated P.fluoresceins

為了進一步研究細胞膜完整性的破損程度，采用流式細胞儀結合SYTO-9和PI雙染法對細胞膜完整性進行定量研究[28]，結果如圖5、6所示。苯乳酸處理的熒光假單胞菌細胞膜完整性與空白對照組相比存在高度顯著差異（P＜0.001）。未經苯乳酸作用的菌體僅有7.2%凋亡的細胞被PI沾染，1/2 MIC、MIC和2 MIC苯乳酸作用于熒光假單胞菌0.5 h后，細胞膜的PI沾染率分別是36.0%、57.6%、86.4%，進一步證實苯乳酸可導致熒光假單胞菌細胞膜完整性受到損傷，且損傷程度與苯乳酸的質量濃度呈正相關。本研究結果與Kang Shimo等[5]研究的熒光假單胞菌細胞膜損傷程度與乳糖醛酸質量濃度呈正相關的結果相同，受試抑菌劑均可以通過劑量依賴的方式破壞細胞膜的完整性。與Liu Fang等[13]通過流式細胞術研究的苯乳酸對陰溝腸桿菌的效果類似，苯乳酸可導致陰溝腸桿菌的細胞膜完整性受損，但該研究所用的苯乳酸劑量較大，為10 mg/mL（相當于本實驗中8 MIC）。與本課題組研究的苯乳酸對大腸桿菌細胞膜作用機制[15]不同，苯乳酸能夠增加大腸桿菌細胞膜滲透性，但不會破壞細胞膜完整性，而對于熒光假單胞菌，苯乳酸不僅可以增加細胞膜滲透性，還會破壞膜完整性，可能與細胞膜結構和組成差異有關。后續將進一步深入研究苯乳酸對革蘭氏陰性菌細胞膜損傷的差異性原因。

圖5 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞膜完整性的流式細胞圖Fig.5 Flow cytometric analysis for of membrane integrity of PLA-treated P.fluoresceins

圖6 苯乳酸對熒光假單胞菌膜完整性的影響Fig.6 Effect of PLA on the membrane integrity of P.fluorescens

2.5 苯乳酸對熒光假單胞菌超微結構的影響

通過掃描電子顯微鏡直觀地觀察了苯乳酸對熒光假單胞菌細胞外部超微結構的變化，結果如圖7所示。空白對照組細胞呈現完整、清晰、飽滿并且表面相對光滑的短桿狀形態；1/2 MIC苯乳酸處理組大部分細胞仍呈正常的形態，但表面粗糙，細胞內容物溢出發生黏連；MIC、2 MIC苯乳酸處理組菌體呈現嚴重破裂并引起細胞原生質的外泄。不同質量濃度苯乳酸對菌體破壞程度的結果與時間-抑菌曲線和流式細胞術等研究結果一致，即1/2 MIC苯乳酸處理組菌體表面與對照組差異并不明顯，熒光假單胞菌的生長未受到抑制，而MIC、2 MIC苯乳酸處理組菌體嚴重破裂，生長受到明顯抑制。說明MIC、2 MIC苯乳酸處理能夠破壞熒光假單胞菌的細胞壁和細胞膜，導致細胞形態改變、局部破裂、原生質泄露，從而抑制熒光假單胞菌的生長繁殖。與酸性電解水對熒光假單胞菌的作用效果[29]不同，酸性電解水作用菌體表面只發生褶皺，細胞黏連，并沒有顯著破損。與Liu Fang等[13]發現質量分數1%和0.5%苯乳酸可導致陰溝腸桿菌胞內物質泄漏的結果一致。本研究結果表明苯乳酸可以破壞熒光假單胞菌細胞膜完整性和滲透性，導致大分子物質泄漏。

圖7 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞超微結構掃描電子顯微鏡圖Fig.7 SEM images of the ultrastructure of P.fluoresceins cells in the presence of PLA

2.6 苯乳酸對熒光假單胞菌蛋白質的影響

蛋白質是生命活動的主要承擔者，干擾或抑制蛋白質的合成可以達到抑菌作用。因此，通過蛋白質凝膠電泳可研究苯乳酸對熒光假單胞菌中蛋白質的影響，結果如圖8所示。與空白對照組相比，1/2 MIC、MIC、2 MIC苯乳酸處理組蛋白條帶數量無明顯變化，MIC、2 MIC苯乳酸處理組蛋白條帶的顏色變淺。結合掃描電子顯微鏡結果，推測苯乳酸嚴重破壞了熒光假單胞菌菌體，導致原有菌體蛋白質發生泄漏。上述研究表明苯乳酸進入細菌內部不會改變蛋白質的表達模式，而是通過破壞細胞膜完整性導致蛋白質等大分子物質泄漏。這與劉韻昕[7]研究的苯乳酸可以抑制銅綠假單胞菌蛋白質的表達不同，推測原因可能為菌體自身抵御酸的方式不同。

圖8 苯乳酸對熒光假單胞菌細胞蛋白質的影響Fig.8 Effect of PLA on proteins of P.fluoresceins

2.7 苯乳酸對熒光假單胞菌DNA的影響

2.7.1 苯乳酸對熒光假單胞菌體外DNA的影響

圖9 苯乳酸對熒光假單胞菌DNA體外作用的影響Fig.9 Effect of PLA on DNA of P.fluorescens in vitro

DNA是生物體內重要的遺傳物質，DNA的破壞會阻礙基因的表達，從而導致正常酶和受體合成的阻滯，使菌體死亡[30]，因此本實驗考察了苯乳酸對熒光假單胞菌DNA的影響。不同質量濃度的苯乳酸對熒光假單胞菌體外DNA的凝膠電泳結果如圖9A所示，空白對照組的DNA條帶顏色明亮，隨著苯乳酸質量濃度的增加，DNA條帶顏色逐漸變暗，且DNA條帶位置輕微下移，說明苯乳酸可以導致DNA發生部分降解，分子質量降低。而MIC、2 MIC苯乳酸處理組的條帶發生彌散，說明菌體體外DNA嚴重降解。采用熒光光譜法進一步研究苯乳酸與DNA的相互作用[31]，如圖9B所示，熒光光譜法與瓊脂糖凝膠電泳實驗結果一致。在抑菌過程中體外DNA熒光強度隨苯乳酸質量濃度升高而降低，MIC、2 MIC苯乳酸作用后的DNA體外熒光強度最低。研究結果與乳糖酸和香豆酸對DNA的影響不同，乳糖酸通過與熒光假單胞菌DNA結合導致熒光猝滅，且猝滅程度與乳糖酸質量濃度無關[5]；香豆酸通過插入到志賀氏菌基因組DNA堿基對中，與DNA堿基相互疊加使熒光強度增強[32]。可能由于有機酸結構不同導致與菌體DNA結合方式不同。由此說明苯乳酸除了作用于熒光假單胞菌細胞膜，還會與DNA結合，通過破壞DNA抑制菌體正常的生長繁殖。

2.7.2 苯乳酸對熒光假單胞菌體內DNA的影響

盡管體外研究結果能夠說明物質對DNA是否產生破壞作用，但由于受到菌體自身保護等多種作用的復雜影響，體內DNA作用程度通常不同于體外的研究結果。因此，本節考察了不同質量濃度苯乳酸對熒光假單胞菌體內DNA的影響。圖10A顯示，空白對照組的DNA條帶單一且顏色明亮。隨苯乳酸質量濃度增加，DNA條帶顏色逐漸變淺，2 MIC苯乳酸與DNA結合作用增強，導致更多DNA無法從點樣孔遷移出，出現輕微的阻滯現象。結合圖10B中熒光假單胞菌體內DNA熒光強度隨苯乳酸質量濃度增加而降低，說明經苯乳酸作用后，熒光發生猝滅，體內DNA含量降低。推測苯乳酸可能與DNA結合，破壞DNA構象和結構，導致DNA泄露或者影響DNA正常的合成代謝。這與劉韻昕[7]研究的苯乳酸對銅綠假單胞菌體內DNA的影響大致相同，體內DNA的含量與苯乳酸的質量濃度呈負相關，而且苯乳酸可以與DNA結合阻礙菌體正常的生長繁殖。結合苯乳酸對熒光假單胞菌的體外DNA實驗分析，體內DNA猝滅程度明顯比體外DNA低，MIC苯乳酸可以使體內DNA發生泄漏，體外DNA嚴重降解。上述現象可能是由于苯乳酸首先作用于細胞壁、細胞膜，然后進入菌體內部再與DNA發生結合，與DNA結合的苯乳酸質量濃度可能會低于處理所用的質量濃度，同時作用過程會受到菌體自身防御機制等因素復雜影響，因此體內DNA的破壞程度低于體外直接作用的破壞程度。總之，本研究結果表明苯乳酸可以干擾DNA正常的合成代謝從而抑制熒光假單胞菌。此外，課題組前期研究發現苯乳酸可以與大腸桿菌的DNA結合，影響DNA復制、轉錄和表達，從而抑制菌體生長[15]。本研究進一步明確了DNA是苯乳酸的抑菌作用靶位。

圖10 苯乳酸對熒光假單胞菌體內DNA的影響Fig.10 Effect of PLA on DNA of P.fluorescens in vivo

3 結 論

苯乳酸可以通過破壞熒光假單胞菌的細胞膜與DNA發揮抑菌作用，即苯乳酸通過消散熒光假單胞菌的跨膜電位，增加細胞膜滲透性，造成細胞內鉀離子顯著泄漏；通過破壞細胞膜完整性，引起細胞形態改變，導致內容物泄漏、菌體發生黏連；進入胞內后可以破壞DNA結構，阻礙基因的表達，從而抑制熒光假單胞菌正常的生長繁殖。該抑菌機制的闡明可為冷藏食品中天然安全生物防腐劑的開發提供理論依據。