黏質沙雷菌磷脂酶A1輔助蛋白S對表達宿主菌大腸桿菌抑制作用機制

甘玉飛，薛正蓮,2,3,，周 杰，王 芳，王 洲,2,3，劉 艷,2,3

（1.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省工業微生物分子育種工程實驗室，安徽 蕪湖 241000；3.微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖 241000）

磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位酰基的水解酶[1]，目前磷脂酶A1在食品、醫療、紡織等行業用途十分廣泛，如被應用在油脂脫膠[2-6]、生產溶血磷脂[7]、加工卵黃等[8]中。磷脂酶A1在微生物中主要由沙雷氏菌屬、假單胞菌、曲霉屬和埃希氏桿菌屬等產生。

Song[9]和Fu Jianhong[10]等將來源于沙雷氏菌MK1和沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1在大腸桿菌中表達，結果發現沙雷氏菌磷脂酶A1基因下游有一段基因與磷脂酶A1在大腸桿菌中高活性的表達密切相關。本課題組前期研究發現，一株來源于黏質沙雷菌的磷脂酶A1基因下游有一段編碼序列，該基因序列的存在也能提高磷脂酶A1在大腸桿菌中的表達活性，并將該基因編碼蛋白命名為磷脂酶A1輔助蛋白S（phospholipase A1 accessory protein S，PlaS）。但無論是磷脂酶A1與PlaS共表達，還是PlaS單獨表達，都表現出對宿主大腸桿菌生長的抑制作用[11-12]。目前國內外對于PlaS的相關研究鮮有報道。

PlaS能提高磷脂酶A1的表達活性，但抑制宿主菌生長的作用又限制了磷脂酶A1酶活力的進一步提高。所以研究PlaS抑制宿主菌的生長機理具有重要意義。N端截短技術被廣泛用于菌株分子改造和蛋白質的結構與功能研究中[13-15]。朱昊等[15]將PlaS的N端區域的前35 個氨基酸截掉之后，發現PlaS對宿主細胞生長的抑制作用消失。同時也有研究表明Sr35蛋白過表達導致了煙草細胞死亡，而Sr35的截短突變體不會觸發細胞死亡[16]。因此本研究將從PlaS的N端進行分析，進行N端截短菌株構建。掃描電子顯微鏡常用于細胞顯微觀察[17]；流式細胞術是一門快速對單個細胞定性定量的技術，可以檢測細胞所發生的形態學變化[18]，許多學者將其應用到抑菌殺菌實驗研究中[19-20]。

本實驗通過N端截短來尋找PlaS對宿主菌生長抑制的關鍵氨基酸序列，同時采用生長曲線檢測對截短結果進行驗證，并用掃描電子顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測大腸桿菌，以探究其抑制機理。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）、質粒pET28a（+）為實驗室保存。P28工程菌是將質粒pET28a（+）直接導入大腸桿菌BL21（DE3）中；SP28工程菌是以質粒pET28a（+）為載體，插入plaS基因，導入大腸桿菌BL21（DE3）宿主菌中。

限制性核酸內切酶BamH I、XhoI和T4連接酶美國賽默飛世爾科技公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、TaqDNA聚合酶、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒和瓊脂糖上海生工生物技術有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；引物合成及DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司進行。

1.2 儀器與設備

T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；S4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；CytoFLEX流式細胞儀 美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基及反應緩沖液的配制

LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，滅菌水溶解后定容至1 L，調pH值至7.0，高溫高壓滅菌后4 ℃保存。

Kan溶液：0.5 g Kan溶解與8 mL滅菌水中，定容至10 mL。用0.22 μm有機系濾膜過濾除菌，分裝（每份1 mL）后-20 ℃保存。

IPTG溶液：稱取1.19 g IPTG溶解于40 mL滅菌水中，定容至50 mL。用0.22 μm有機系濾膜過濾除菌，分裝（每份1 mL）后-20 ℃保存。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）：稱取Na2HPO42.2 g、NaH2PO40.2 g、NaCl 8.5 g，滅菌水定容至1 L。

1.3.2 PlaS氨基酸序列分析

利用生物信息學網站對PlaS進行信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、疏水結構（https://web.expasy.org/protscale/）以及跨膜區（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析。

1.3.3 PlaS N端截短菌株構建

通過生物信息學網站分析，設計各個截短菌株（dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28，以dS23P28為例，即表達PlaS N端截短前23 個氨基酸后的蛋白的菌株，其他菌株以此類推）的上游引物，以及它們共同的下游引物（表1），利用PCR技術，以SP28質粒為模板，對截短輔助蛋白基因進行擴增，反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環；72 ℃延伸10 min。然后選用XhoI和BamH I為限制性內切酶，分別對膠回收后的擴增產物和pET28a（+）質粒進行雙酶切，再用T4連接酶將二者4 ℃過夜連接構成重組質粒，經過化學轉導法將質粒導入大腸桿菌BL21（DE3）中，恢復培養后涂布于50 μg/mL Kan篩選平板培養基上37 ℃培養過夜，隨后挑取單克隆，接種到含50 μg/mL Kan的LB培養液中培養，然后用培養好的菌液提取質粒，并進行雙酶切驗證，驗證條帶準確的菌株送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

表1 N端截短菌株PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences used for polymerase chain reaction for construction of N-terminal truncated mutants

1.3.4 生長曲線測定

將生長至對數生長期的菌液稀釋至OD600nm為0.2，按2%（體積分數）接種量接到100 mL LB+50 μg/mL Kan培養基中培養，待菌液OD600nm為0.6左右時加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG進行誘導，整個期間每隔2 h取樣一次，用紫外-可見分光光度計測定OD值，以空載菌株P28為對照，培養條件為37 ℃、200 r/min。構建菌株的生長曲線均按照此方法進行測定。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

用掃描電子顯微鏡觀察菌株P28、SP28、dS27P28的顯微形態，以空載菌株P28為對照。將各個菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養基中，37 ℃、200 r/min培養至OD600nm為0.6左右，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導。之后分別取誘導0、4、8、12 h的菌液，用離心法收集菌體沉淀至綠豆大小，用PBS（pH 7.4）洗滌后在4 ℃下與體積分數2.5%的戊二醛混合6 h進行固定。固定后的菌體在PBS中沖洗兩次，每次20 min，再用乙醇（體積分數依次為30%、50%、70%、85%、95%、100%）進行梯度脫水，每次20 min。用無水丙酮置換出乙醇后，將細菌沉淀用二氧化碳臨界點干燥法干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6 細胞膜通透性檢測

將菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養基中，在37 ℃、200 r/min培養至OD600nm為0.6左右，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導。誘導0、4、8、12 h時取1 mL菌液，4 ℃、4 000 r/min下離心10 min。用PBS（pH 7.4）洗3 次。將碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料加入重懸的菌液，4 ℃避光下染色30 min。染色后將菌液過200 目的尼龍篩，放置于流式細胞儀中檢測。檢測以10 μL/min低速率記錄100 000 個細胞，用488 nm激發光檢測紅色熒光轉化的數字信號。

1.3.7 PlaS N端27肽理化性質分析

使用在線程序ExPASyp-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）和Heliquest（http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py）對PlaS N端27肽的分子質量、等電點、凈電荷、疏水性、疏水力矩進行分析。

1.4 數據處理與分析

采用Excel軟件進行數據處理，采用Origin軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析PlaS氨基酸序列信息

圖1 PlaS氨基酸信息分析Fig.1 Amino acid sequence analysis of PlaS

對PlaS進行信號肽分析發現，該蛋白存在信號肽，為前23 個氨基酸（圖1A）。有研究表明，在原核表達過程中，外源信號肽的存在會影響蛋白質的正常表達[21-23]，如郭磊周等[24]研究發現耐輻射異常球菌疏水性LEA5C家族蛋白（DrwH）含有信號肽序列，DrwH蛋白過量表達抑制了大腸桿菌的生長。通過跨膜區及蛋白疏水性在線分析，發現蛋白前7～26 個氨基酸為典型的跨膜區域（圖1B），第10～27個氨基酸為疏水區（圖1C），有研究表明截去蛋白疏水區可高效穩定表達外源蛋白[25-26]。綜上，推測PlaS前23～27 個氨基酸有可能與PlaS在大腸桿菌中的表達特性及其對大腸桿菌生長抑制現象有關。

2.2 PlaS N端截短菌株構建結果

對1.3.3節構建的菌株進行測序，測序結果和plaS全長基因進行比對，發現dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28都缺少了它們各自需要截短的氨基酸，且未截短部位突變少，相似度高，這表明PlaS N端截短菌株構建成功。圖2為PlaS N端截短菌株的N端序列比對結果，使用DNAMAN軟件進行比對。

圖2 PlaS N端截短菌株測序比對Fig.2 Sequence comparison of PlaS N-terminal truncated strains

2.3 不同PlaS N端截短突變株異源表達生長特性變化

圖3 PlaS N端截短菌株生長曲線Fig.3 Growth curves of PlaS N-terminal truncated strains

以菌株SP28和構建成功的N端截短系列菌株進行了生長曲線測定，結果如圖3所示。在未加誘導劑IPTG時菌株生長狀況一致，在加入IPTG誘導蛋白表達后dS27P28菌株生長情況良好，一直呈現指數增長狀態，而表達PlaS的菌株SP28呈現相反情況，生長最慢，其他截短菌株在蛋白誘導表達后均出現不同程度的生長抑制，由此可推測前27 個氨基酸的存在對其表達宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

2.4 PlaS N端截短對大腸桿菌形貌的影響

圖4 PlaS表達菌株掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of PlaS expression strains

細菌細胞膜的破壞能導致細菌死亡。為了探討PlaS是否通過破壞細胞膜來抑制大腸桿菌的生長，采用掃描電子顯微鏡對細胞膜進行了觀察。如圖4所示，在細胞生長過程中，對照組P28菌株有完整、光滑、規則的形態結構（圖4A～D）。相反，表達PlaS的菌株SP28隨時間變化的最顯著特征是細菌變形、破損。在4 h出現了褶皺、干枯（圖4F），在8 h出現部分細胞破損、壓縮（圖4G），在12 h出現細胞大量破損，細胞形態變得不完整（圖4H）。而表達截短N端27 個氨基酸的PlaS菌株dS27P28又恢復了完整、光滑、有規則的形態結構，且隨時間延長未出現破損情況（圖4J～L）。這些現象說明PlaS對大腸桿菌細胞膜具有嚴重的損傷作用，也進一步說明了PlaS N端前27 個氨基酸的存在對其表達宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

2.5 PlaS N端截短對大腸桿菌細胞通透性影響

為了進一步探究PlaS對大腸桿菌細胞膜的破壞情況，采用流式細胞技術進行了定量分析。熒光染料PI能夠進入細胞膜損傷的細胞與核酸結合，而有完整細胞膜的細胞則不會被染色。用PI染料分別對誘導0、4、8 h的SP28和dS27P28菌株染色，并進行流式細胞儀檢測。結果可以看出，隨著時間推移，SP28菌株細胞膜損傷的細胞比例在0 h時為9.54%（圖5A），4 h時為48.72%（圖5B），8 h時達到了66.92%（圖5C）；相比之下，如圖5D～F所示，dS27P28菌株細胞膜損傷率增長則慢的多，8 h時為13.69%。這說明了PlaS對細胞膜有損傷影響，而PlaS的N端截短27 個氨基酸后則損傷現象消失，與掃描電子顯微鏡觀察結果一致。

圖5 流式細胞儀檢測的細胞膜完整性Fig.5 Detection of cell membrane integrity by FCM

2.6 PlaS N端27肽的理化性質分析結果

PlaS N端27肽序列為MPEGRRLRRA LAIALLALAAVTGLLMM。ExPASyp-ProtParam tool軟件顯示該蛋白質序列分子式為C128H231N39O31S3、分子質量為2 908.66 Da、等電點為12。Heliquest軟件分析得到該肽凈電荷為+3、疏水性值為0.621 11、疏水力矩為0.147 12、疏水面為ALLLL，螺旋投影圖由Heliquest軟件得到（圖6）。根據軟件分析結果，PlaS N端27肽為帶陽離子正電荷的疏水性肽。Lin Yanlan等[27]通過設計分析一組新型陽離子抗菌肽，以進一步了解抗菌肽與細胞膜的脂質的相互作用，結果發現疏水性強的抗菌肽與細胞膜親和性強；Hollmann等[28]選擇了兩種多肽——P5和P6.2進行進一步研究，發現它們對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有殺傷活性，同時破壞了兩株菌的細胞膜的完整性。因此PlaS對大腸桿菌的抑制作用可能是N端前27 個氨基酸陽離子的疏水性導致的。這27 個氨基酸組成肽的具體功能后續將做進一步的研究。

圖6 PlaS N端27肽螺旋投影圖Fig.6 Spiral projection of first 27 N-terminal amino acids of PlaS

3 討 論

本究結果顯示PlaS在大腸桿菌體內表達后對其生長有較強的抑制作用，同時通過N端截短技術發現其抑制作用關鍵區域為PlaS N端前27 個氨基酸，且通過生長曲線測定、掃描電子顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測細胞膜通透性實驗驗證了這一結論。

掃描電子顯微鏡觀察到PlaS表達菌株在4 h出現了褶皺、干枯，在8 h時出現部分細胞破損、壓縮，在12 h時相比出現大量破損，結構變得不完整。這初步揭示了PlaS主要通過破壞大腸桿菌細胞形態的完整性抑制其生長。很多學者研究表明細胞膜的完整性對于細菌生長至關重要，細胞損傷直接抑制了細菌的生長[29-32]，而一般細胞破損會引起離子（K+、Na+、Ca2+）的泄漏[33]，這會影響細胞正常的生命活動，其存活所需的各種生物酶也將不會被合成。流式細胞儀數據顯示在SP28菌株誘導表達8 h時細胞膜損傷率達到66.92%，也進一步驗證了PlaS對大腸桿菌細胞膜有損傷作用。

對PlaS N端前27 個氨基酸組成的多肽進行了理化分析，結果顯示其為陽離子疏水性多肽。微生物膜通常呈現陰離子表面，富含脂質（如磷脂酰甘油），而陽離子與疏水性非常適合與微生物膜作用[34-35]。根據這個特點此27肽有望開發成新型抗菌肽。

PlaS對其表達宿主大腸桿菌生長抑制及細胞損傷的分子機理還有待后續深入研究，可通過轉錄組和蛋白組學技術比較SP28菌株和PlaS N端截短菌株之間與細胞膜合成有關基因（如oppA、ompA、lpxT、plsB等[36]及與細胞壁合成有關基因Pal、MtgA、NagA等[37]）的轉錄和表達水平。