一株梅尼小環藻的分離純化及鑒定

游 宇

(福建省水產技術推廣總站，福建 福州 350002)

近年來，菲律賓蛤仔、縊蟶、美洲簾蛤等貝類育苗產業快速發展，尋找優質的硅藻種源、開展池塘藻類的定向規模化穩定培育，已成為貝類產業重要的技術需求。本文從福建省東山近海的養殖海水中分離得到了一株土著硅藻優勢種。通過普通光學顯微鏡以及掃描電子顯微鏡分析觀察，明確了該土著藻種的形態特征類同于梅尼小環藻，然后基于18S rRNA 基因以及rbcL 基因的基因序列開展了分子鑒定，確定為梅尼小環藻。梅尼小環藻(Cyclotella meneghiniana)隸屬于硅藻門、中心藻綱、圓篩藻目、圓篩藻科、小環藻屬，大部分生活在淡水環境中，少數生活在一些咸水湖或者海洋環境中(李長玲，2017)。

一、材料與方法

福建省東山縣近海的魚蝦混養池塘中，初步發現一株硅藻優勢種，然后基于水滴分離法和微管分離法進行分離純化，并采用f/2培養基，按如下條件在光照培養箱中擴培保種：光照強度范圍為100～200 微摩/(米2·秒)，光暗周期為晝12∶夜12，培養溫度(22±1)℃，每天定時搖藻3～5次。

1.光學顯微鏡觀察

該株硅藻優勢種經過分離純化后進行形態鑒定及分子鑒定，確定其所歸屬的種屬。在光學顯微鏡10×100倍下觀察并拍照，依據形態學特征進行初步鑒定。

2.電鏡觀察

取來新鮮并處于硅藻對數生長期的水樣50 毫升左右，濃縮水樣呈藻泥狀。制備硅藻殼：進行離心濃縮后留1毫升樣品于試管中，加入同等體積(1 毫升)的分析純濃鹽酸，100℃水浴鍋中加熱22 分鐘，直至原生質被除掉；用蒸餾水清洗12 次，將樣品洗至中性，再干燥后鍍金。之后用Jeol JSM-6390LV掃描電子顯微鏡觀察。

3.分子鑒定

(1)基因組DNA 提取。用植物DNA 試劑盒進行提取。18S rRNA 和rbcL 基因序列的擴增用Taq PCR 混合試劑盒進行。反應體系為25 微升∶12.5 微升Taq Master MIX；上下游引物各1.0 微升(引物保存濃度10 微摩/升)；DNA 模板1.0 微升；最后加9.5微升dH2O定容到25微升。PCR循環擴增在iCycler 中進行。PCR 反應條件為：94℃預變性4 分鐘，94℃變性30 秒，51.4℃退火30 秒，72℃延伸2 分鐘，共計35 個循環，然后72℃延伸10分鐘。

PCR 擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，凝膠成像系統記錄實驗結果。隨后用TAKARA 凝膠試劑盒進行純化，送至廈門鉑瑞生物技術公司測序。

(2)序列分析。將測序結果通過NCBI數據庫進行Blast 在線比對。用DNAstar 中Editseq 軟件統計序列的堿基含量，用MEGA 7 軟件分析序列特征、同源性和遺傳距離，并基于Neighbor Joining(NJ)構建系統發育樹。

二、結果

1.形態特征

光學顯微鏡下觀察如圖1。用目鏡測微尺對分離到的梅尼小環藻進行初步的直徑測量，發現該藻的直徑在5～16微米。

圖1 光學顯微鏡下觀察梅尼小環藻

在光學顯微鏡下可觀察到該藻有兩個面，一個殼面呈圓形，另一個殼面為方形。有部分藻細胞通過殼面相連聚集在一起，部分連成短鏈狀群體(2～3 個細胞)，部分則為單細胞。細胞形狀呈現鼓形、短圓的柱狀，多數具有多個小盤狀的色素體，顏色為鮮綠色。該藻光學顯微鏡下的顏色、大小、形狀都符合梅尼小環藻的特征。

在電鏡下觀察該梅尼小環藻亞顯微結構，從梅尼小環藻樣品的外部觀察，在殼面中央區域有凹凸，中心區域大約占了殼面的1/2，上面還有一些不規則的顆粒——二氧化硅顆粒。其邊緣區域包括條紋區域、非條紋區域且圍繞著中央區，兩者互為間隔分布。每5 微米左右就有5～8 個條紋，且每個條紋包含有4行網紋，網紋從中央區域邊緣延伸到殼套處。再從內部殼面觀察，可見殼面中央區有1個中央支持突，支持突由3個圍孔圍著。在邊緣區，可以看到有6～13 個的殼緣支持突，每個殼緣支持突分別有兩個圍孔圍繞著，且在殼緣區域能看見單一的唇形突。

2.分子鑒定

實驗中擴增得到該土著硅藻優勢種的18S rRNA 基因序列，大小約1 680 bp。擴增得到rbcL基因序列，大小約1 400 bp。用MEGA 的Kimura 雙參數模型進行計算，分析13 株小環藻18S rDNA 的同源性及遺傳距離結果。

小環藻物種間18S rDNA 之間的遺傳距離閾值范圍介于0.001～0.063。小環藻物種間rbcL 基因的同源性為90.40%～100%，遺傳距離為0.000～0.100。其中該株硅藻18S rDNA與5株Genebank中梅尼小環藻的同源性為99.80%，遺傳距離僅為0.002；同樣，該株硅藻rbcL 基因序列與5 株梅尼小環藻同源性分別為99.50%、99.40%、99.40%、99.50% 和99.40% ， 遺 傳 距 離 分 別 為0.005、0.006、0.006、0.05和0.006，可知它們的同源性高，遺傳差距小，親緣關系較近。

將18S rRNA 基因序列和rbcL 基因序列分別進行Blast 比對和聚類分析，與數據庫中已有的5 株梅尼小環藻的18S rRNA 序列聚為一類，包括4 株淡水梅尼小環藻和1 株海水梅尼小環藻(來自中國湛江)均聚為一類。

三、討論

本文通過水滴分離法和微管分離法從福建省漳州市東山海域的對蝦養殖池中分離到1株硅藻優勢種，并基于顯微和亞顯微的形態觀察以及分子鑒定技術，開展了該株硅藻鑒定。本文分離到的硅藻優勢種的花紋與細胞壁、殼面形態、殼縫、軸面等形態特征，符合梅尼小環藻的形態特征。

硅藻的生境特征也是分類學上的重要參考，其中鹽度被認為是微藻分布的重要屏障，通常同一株微藻較少能同時高度適應海水和淡水。但也有例外，T. gessneri 作為一個大的藻類分支，在海洋、半咸水和淡水都有生存的物種(Alverson，2007)。同樣，小環藻也是“廣鹽性”物種， 特別是梅尼小環藻的淡水物種與海水物種同屬一個物種，這表明它可能代表為數不多的由海洋棲息地到淡水轉變的分類群(李長玲等，2017；Scheggia Q J，2009)。

因此，從分類學上來說，僅僅依據形態學差異和生境特征來鑒定物種，可能發生一定的差錯，特別是淡水和海水的梅尼小環藻很有可能會被錯誤地鑒定為不同的物種，于是分子鑒定技術就發揮了重要作用，在硅藻物種的分類和界定研究上具有重要意義。許多學者利用18S rRNA 基因鑒定了各類硅藻，并且用系統發生樹對它們間的親緣關系進行了分析鑒定(Sorhannus，2017；Stepanek，2014)。本文采用18S rRNA 和rbcL 基因開展的分子鑒定結果表明，18S rRNA 和rbcL 基因的大多數序列結果和相應序列的相似度在95%以上，并且該梅尼小環藻與海水、淡水的梅尼小環藻都在一個聚類分枝上。

此外，小環藻是對蝦養殖中后期池塘常見的優勢種，也是雙殼貝類的優質餌料，其直徑為5～16 微米，特別適合貝類幼蟲與稚貝攝食。利用池塘的天然微藻進行雙殼貝育苗及養殖是近年來重要的產業發展方向，特別是硅藻定向培養技術不僅對于維持對蝦池塘的生態穩定，而且對于促進雙殼貝類的規模化養殖具有重要意義。

特定海域的硅藻土著種是經過長期的自然選擇并適應當地環境條件的類型，開展土著種特別是優勢土著種的分離純化，可為定向培育提供適應海域環境的優質硅藻種源。福建省漳州市是重要的蟶苗和菲律賓蛤仔的苗種產地和養殖區，貝類餌料生物的種類和質量對于產業發展非常重要，已有研究表明，采用硅藻及其他藻類的混合投喂方式可有效促進稚貝生長(何進金，1984)。本文分離純化了1株屬于福建省漳州市的硅藻優勢種，并鑒定為梅尼小環藻，也是優質的貝類餌料，對于促進魚、蝦、貝生態耦合養殖具有重要意義。