炎癥微環境下miR-30a調控Runx相關轉錄因子2對人牙周膜干細胞成骨分化的影響

林 麗，張 卓，哈斯達來，王 博，劉翠娟，馬稔秋，付澤宇

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院口腔科，遼寧 錦州 121001;2.赤峰學院附屬醫院口腔科，內蒙古 赤峰 024005)

牙周炎是一種發生于牙周支持組織的慢性炎癥，因牙齦卟林單胞菌、伴放線菌、變形鏈球菌等微生物感染引起，可破壞牙槽骨吸收及骨形成之間的動態平衡，使其骨吸收大于骨形成，導致牙槽骨的高度降低，阻止炎癥進展，促進牙周組織的修復再生在牙周炎的治療中至關重要[1-2]。人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)來源于人牙周膜內間質的未分化細胞，可分化形成牙骨質或牙周膜樣結構，具有再生修復牙周組織的作用[3-4]，而炎癥可影響hPDLSCs的成骨分化能力，減弱其對牙槽骨及牙周組織的修復功能[5-6]。Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)與成骨分化密切相關，能誘導不成熟骨細胞分化成熟，還可促進hPDLSCs向成骨細胞分化[7-8]，由此推測，Runx2是調控炎癥微環境下hPDLSCs成骨分化的一個作用靶點。微小RNA-30a(miR-30a)在牙周炎牙齦和牙槽骨組織中高表達，并抑制炎性環境下骨代謝及成骨細胞活性，另外miR-30a可與Runx2的3’-非翻譯區結合抑制Runx2的表達，但miR-30a是否可通過調控Runx2影響炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化，目前還不清楚，本文通過構建體外hPDLSCs炎癥模型，對此進行探索。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑及儀器 hPDLSCs(上海圻明生物科技有限公司，批號Sci-L-0684)；miR-30a mimics、miR-30a mimics陰性對照、miR-30a inhibitor、miR-30a inhibitor陰性對照(上海吉瑪基因有限公司，批號JM1037、JM1158、JM2019、JM2027)；DMEM培養基(武漢益普生物科技有限公司，批號PM150210)；胎牛血清、PBS緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司，批號11011-8611、P1022、T1300、P1400)；Opti-MEM培養基、LipofectamineTM2000(美國invitrogen公司，批號51985091、11668019)；人白細胞介素-6(IL-6)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，批號GD-DS1726)；人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司，批號DS-535)；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號40749ES60)；茜素紅染色液(上海聯碩生物科技有限公司，批號N/A-899)；RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號9108、RR037Q/A/B、639519)；兔源Runx2、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)及GAPDH一抗、羊抗人二抗(美國Abcam公司，批號ab23981、ab63856、ab93876、ab181602、ab6721)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司；批號C006325-0150、P0011)。光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號CKX41-F32F)；酶標儀(山東博科生物產業有限公司，型號BK-EL10C)；熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司，型號CFX96 Touch Deep Well、1659001、Trans-Blot Turbo)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司，型號Centrifuge 5424R)；凝膠成像系統(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號IBright CL 1500)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養及培養基配制：完全培養基：向500 ml DMEM培養基中加入胎牛血清和青鏈霉素混合液，使其終濃度分別為10%、100 U/ml，上下顛倒混勻。成骨誘導分化培養基：向500 ml完全培養基中加入地塞米松、維生素C及β-磷酸甘油鈉，使其終濃度分別為10、50 μmol/L、10 mmol/L，上下顛倒混勻。購買的凍存hPDLSCs細胞株置于37 ℃水浴中，快速凍融后離心5 min(室溫，1000 r/min)，以完全培養基洗滌細胞沉淀后重懸，接種在25 cm2培養瓶中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，當細胞鋪滿瓶底時，以胰酶消化，并以1∶3的比例傳代培養。

1.2.2 細胞轉染及標本收集：取1.2.1中指數生長期的細胞，以胰酶消化后重懸并計數，接種在4個24孔板中，培養24 h，各板細胞隨機分為對照組、模型組、miR-30a mimics組、miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor組、miR-30a inhibitor陰性對照組，除對照組外，其余各組以10 μg/ml的脂多糖處理細胞，構建體外炎癥微環境，24 h后轉染細胞，步驟如下：將完全培養基更換成Opti-MEM減血清培養基培養細胞，將1 μl LipofectamineTM2000溶于50 μl Opti-MEM減血清培養基中，小心混勻，同時分別將miR-30a mimics、miR-30a mimics陰性對照、miR-30a inhibitor、miR-30a inhibitor陰性對照(濃度參照說明書)溶解于50 μl Opti-MEM減血清培養基中混勻，均靜置20 min后分別與LipofectamineTM2000溶液混勻后，分組處理細胞，6 h后，以成骨誘導分化培養基更換Opti-MEM減血清培養基，繼續培養2周后，選取兩個24孔板分別用于后續ALP染色及茜素紅染色實驗，剩余2個24孔板中的各組細胞收集后分別用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白檢測。

1.2.3 ALP染色及茜素紅染色實驗：取1.2.2中兩個24孔板，吸去培養基，以PBS漂洗后，加入4%多聚甲醛固定2 h，采用ALP染色試劑盒及茜素紅染色液分別對各組細胞進行染色(具體步驟參照說明書)，在光學顯微鏡下觀察，呈現紫色的為ALP陽性細胞，呈現紅色的為礦化結節，每組任選5個視野拍照，計數ALP陽性細胞數及礦化結節數，并計算其各組相對比例，對照組設為100%，相對比例=實驗組ALP陽性細胞數(礦化結節數)/對照組ALP陽性細胞數(礦化結節數)×100%。

1.2.4 細胞上清液中TNF-α及IL-6水平檢測：取1.2.1中指數生長期的細胞，以胰酶消化后重懸并計數，接種在24孔板中，培養24 h，參照1.2.2中的方法轉染細胞，繼續培養24 h后，收集各組細胞上清液，以ELISA試劑盒測定其中TNF-α、IL-6水平，具體步驟參照說明書進行。

1.2.5 qRT-PCR分析各組細胞miR-30a、Runx2 mRNA的表達：取出1.2.2中收集的各組細胞，加入RNAiso Plus提取各自總RNA并以逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，然后以熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，具體步驟、反應體系配制、反應條件設定均參照各自說明書進行，以GAPDH為Runx2的內參基因，U6為miR-30a的內參基因，采用2-ΔΔCt算法統計分析所得數據，進而得出各組mRNA相對表達量，qRT-PCR引物序列見表1。miR-30a、Runx2、U6、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 免疫印跡分析各組細胞Runx2、OPN、OCN蛋白的表達：取出1.2.2中收集的各組細胞，以蛋白提取試劑盒提取總蛋白后使用BCA試劑盒測定其總濃度，調整各組蛋白濃度至相同，煮沸變性，各取10 μl樣品液上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離蛋白全部轉移至硝酸纖維素膜上，根據目的蛋白分子量截取條帶置于小盒中，加入5%的脫脂奶粉，室溫進行封閉2 h，然后分別經兔源Runx2、OPN、OCN及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，羊抗人二抗室溫孵育2 h后，采用ECL顯色，以凝膠成像系統拍攝蛋白條帶，并以Image Lab軟件分析各組蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 ALP染色檢測miR-30a對各組細胞成骨分化的影響 與對照組相比，模型組ALP陽性細胞相對比例降低(P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組ALP陽性細胞相對比例均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組ALP陽性細胞相對比例升高(P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組ALP陽性細胞相對比例無明顯變化(均P>0.05)，見表2(圖1)。

表2 各組細胞ALP陽性細胞相對比例(%)

2.2 茜素紅染色檢測miR-30a對各組細胞成骨分化的影響 與對照組相比，模型組細胞礦化結節相對比例降低(P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細胞礦化結節相對比例均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細胞礦化結節相對比例升高(P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細胞礦化結節相對比例無明顯變化(均P>0.05)，見表3(圖2)。

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖1 各組細胞成骨分化(ALP染色，×200)

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖2 各組細胞成骨分化(茜素紅染色，×200)

表3 各組細胞礦化結節相對比例(%)

2.3 miR-30a對各組細胞上清液中炎癥因子水平的影響 與對照組相比，模型組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均升高(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均降低(均P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表4。

表4 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較(ng/ml)

2.4 各組細胞miR-30a、Runx2 mRNA表達水平比較 與對照組相比，模型組細胞miR-30a表達水平均升高(均P<0.05)，Runx2 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-30a mimics組細胞miR-30a表達水平升高(P<0.05)，Runx2 mRNA表達水平降低(P<0.05)；miR-30a inhibitor組細胞miR-30a表達水平降低(P<0.05)，Runx2 mRNA表達水平升高(P<0.05)；miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細胞miR-30a、Runx2 mRNA表達水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表5。

表5 各組細胞miR-30a、Runx2 mRNA表達水平比較

2.5 miR-30a對各組細胞成骨相關蛋白Runx2、OPN、OCN表達的影響 與對照組相比，模型組細胞成骨相關蛋白Runx2、OPN、OCN表達水平均降低(均P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達水平均升高(均P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細胞成骨相關蛋白表達水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表6(圖3)。

表6 各組細胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達水平比較

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖3 各組細胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達

3 討 論

牙周炎不僅可導致劇烈疼痛、牙齒損壞，還可能誘發心血管疾病，對居民身心健康，特別是口腔健康存在重大威脅[9-12]。組織再生工程技術是修復牙周組織，改善牙周炎臨床癥狀的重要治療手段，hPDLSCs具有自我更新和分化為牙周膜、牙骨質等多種牙周組織細胞的能力，是組織工程技術中很好的種子細胞[13-14]，但hPDLSCs慢性炎癥微環境下再生及分化能力明顯降低[15]。本文以脂多糖誘導炎癥，構建hPDLSCs體外炎癥微環境模型，結果顯示，hPDLSCs經脂多糖處理后，細胞上清液中促炎因子TNF-α及IL-6水平升高，ALP陽性細胞相對比例、礦化結節相對比例、細胞成骨分化相關蛋白OPN及OCN表達水平降低，表明脂多糖可引發hPDLSCs產生炎癥，抑制其向成骨細胞分化，模型建立成功。

miR-30a是一種非編碼RNA分子，可調控多種信號通路傳導，介導炎癥反應，細胞增殖、凋亡及分化等生理過程。miR-30a可下調過氧化物酶體增殖物激活受體γ的共同激活劑Ppargc1b的表達，促使炎癥進展，加劇自身免疫性腦脊髓炎癥狀[16]，并可抑制骨形態發生蛋白9(BMP9)誘導的C3H10T1/2和C2C12細胞的成骨分化[17-18]。本研究發現，與對照組相比，模型組細胞miR-30a表達水平升高，推測炎癥微環境下miR-30a高表達，可能調控炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化。本研究通過使用miR-30a mimics及inhibitor調控炎癥微環境下hPDLSCs中miR-30a的表達對此進行探索，結果顯示，miR-30a mimics處理細胞可升高細胞上清液中TNF-α及IL-6水平，降低ALP陽性細胞相對比例、礦化結節相對比例、細胞成骨分化相關蛋白OPN及OCN表達水平，miR-30a inhibitor處理細胞，則作用相反。表明miR-30a參與脂多糖誘導的hPDLSCs炎癥反應及其成骨分化，上調miR-30a表達，可促進炎癥進展，抑制炎癥微環境下hPDLSCs向成骨細胞分化，下調miR-30a表達，可抑制炎癥進展，促進炎癥微環境下hPDLSCs向成骨細胞分化。Runx2是一種成骨分化相關因子，可增強間充質干細胞及hPDLSCs的成骨分化[19]。研究顯示，miR-30a可與Runx2的3’-UTR結合，進而調節Runx2的表達，抑制破骨細胞的分化和骨溶解過程[20]，但miR-30a是否可通過調控Runx2的表達而介導炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化，目前還未見闡釋。本文結果顯示，與對照組相比，模型組細胞Runx2 mRNA和蛋白表達水平降低，進一步分析發現，miR-30a mimics處理炎癥微環境下hPDLSCs可降低細胞Runx2 mRNA和蛋白表達，miR-30a inhibitor處理細胞則作用相反，表明miR-30a可抑制Runx2表達，加重炎癥，抑制炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化。

綜上所述，炎癥微環境下hPDLSCs中miR-30a高表達，可抑制Runx2的表達，促進脂多糖誘導的hPDLSCs炎癥進展及其成骨分化，下調miR-30a水平，可促進Runx2表達，抑制炎癥發展，增強炎癥微環境下hPDLSCs中成骨相關因子OPN、OCN、ALP的表達水平，促使其向成骨細胞分化，揭示miR-30a是牙周炎的一個潛在治療靶點，為臨床治療牙周疾病提供了新的參考，調控Runx2的表達可能是其作用機制。但本文未通過上調或下調Runx2表達對miR-30a調控炎癥微環境下hPDLSCs的成骨分化進行對照驗證，還存在一定不足，還需進行后續的深入研究，得出更為精確完整的作用機制。