枇杷葉膠囊的制備及質量標準研究

（惠州衛生職業技術學院 藥學系，廣東 惠州 516025）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷的干燥葉，別名巴葉、蘆橘葉，全年均可采收[1]。《中藥大辭典》記載道：枇杷葉具有清肺和胃、降氣化痰功能，是治療肺熱咳喘的要藥[2]。因其獨特的藥用價值，在現代醫學中的應用也非常普遍。枇杷葉中的化學成分多樣，目前從中分離出來的成分主要有三萜酸類、黃酮類、揮發油、有機酸類、多酚類、皂苷類等[3]。目前藥理研究表明其主要有效成分集中在三萜酸類化合物[4]，具有良好的鎮咳、祛痰和平喘等作用[5]，三萜酸中以熊果酸和齊墩果酸的含量最高[6]，可作為枇杷葉的質量評價指標[7]。百姓素有使用枇杷葉水煎液的習慣，但其存在著不易保存、不便攜帶等不足之處。中藥膠囊劑具有質量穩定、易存儲、使用和運輸方便等優點。課題組前期已以熊果酸和齊墩果酸為指標，對枇杷葉進行了提取工藝的優選[8]，本研究以流動性、吸濕性、成型性[9]、輔料用量為考察指標，確定枇杷葉膠囊的最佳制備工藝，并初步建立簡單可行的枇杷葉膠囊質量標準，為其進一步產業化研發提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JA3003電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；BPG-9240A鼓風干燥箱（上海百典儀器設備有限公司）；BJ-3崩解時限測試儀（鄭州南北儀器設備有限公司）；PS-40A超聲波清潔機（深圳市科潔超聲科技有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Thermo ODS-2 Hypersil色譜柱（賽默飛世爾科技公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵（鄭州博科儀器設備有限公司）。

1.2 試劑與試藥

淀粉，糖粉，微晶纖維素，可溶性淀粉（山東聊城華陽醫藥輔料有限公司）；乳糖，醋酸銨（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；甲苯，丙酮（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；硫酸，無水乙醇（分析純，臺山市粵僑試劑塑料有限公司）；乙腈，甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水（蒸餾水，屈臣氏飲用水有限公司）；熊果酸對照品，齊墩果酸對照品（北京世紀奧科生物技術有限公司）；枇杷葉對照藥材（上海一研生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 輔料的選擇

因枇杷葉濃縮液真空干燥后成塊狀黏連固體，不利于進一步制劑，故選擇濕法制粒后，再填充膠囊。

2.1.1 單一輔料的考察 取5份枇杷葉稠膏，各5 g，分別加入一定量的淀粉、可溶性淀粉、乳糖、糖粉、微晶纖維素，混合制粒，以輔料用量、休止角、吸濕率、成型狀態為指標，考察結果見表1。由表1可見，淀粉的流動性最好，乳糖的吸濕性最好。但乳糖和糖粉用量大，會增大藥品的服用量，故排除乳糖和糖粉；可溶性淀粉不易混合均勻；淀粉用量稍大，顆粒細粉多，但價格低廉；微晶纖維素用量少，顆粒細粉多，價格較高。綜合以上因素，不宜使用單一輔料進行制劑，需進一步對配伍輔料進行考察。

表1 單一輔料考察結果

2.1.2 配伍輔料的考察 取5份枇杷葉稠膏，各5 g，加入不同比例的微晶纖維素和淀粉進行制粒，以輔料用量、休止角、吸濕率、成型狀態為指標，考察結果見表2。由表2可見，各配比輔料制得的顆粒流動性均符合制劑要求，各比例的吸濕性差別不大，結合考慮輔料用量和成型性兩因素，確定選用微晶纖維素與淀粉配比為1:1作為輔料制粒，稠膏與輔料的比例約為1:1。

表2 配伍輔料考察結果

2.2 膠囊殼的選擇

2.2.1 堆密度測定 取顆粒3份，各約4 g，精密稱定，填充于10 ml量筒中，由5 cm高度處落在木板上，反復振動3次后，測定顆粒的體積（V），根據公式ρ=m/V計算堆密度，測得堆密度分別為0.409，0.411，0.407 g/ml，均值為0.409 g/ml。

2.2.2 膠囊殼的裝量 按2015年版《中國藥典》[10]，枇杷葉藥材的使用量為6～10 g，藥材中熊果酸和齊墩果酸總含量不低于0.70 %折算，設計以每粒膠囊應含熊果酸和齊墩果酸不得少于5 mg，每人每天服用3次，每次3粒計算，通過預測試顆粒的含量，推測出每粒膠囊約裝0.2 g。結合堆密度的測定結果，根據膠囊殼型號和近似容積的關系，選擇1號空心膠囊（近似容積為0.5 ml）分裝。

2.3 枇杷葉膠囊制備

取枇杷葉690 g，采用80 %乙醇提取，液料比為12:1，回流提取2次，每次1 h[8]。80 ℃減壓濃縮，得稠膏約138 g，相對密度約為1.24，加入輔料[微晶纖維素-淀粉（1:1）]140 g，制粒，干燥，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

2.4 膠囊劑的檢查

根據2015年版《中國藥典》對膠囊劑的要求，對膠囊劑作外觀、水分、裝量差異、崩解時限檢查[11]。

2.4.1 外觀與性狀 膠囊外觀整潔，無黏結、變形及破裂現象，無異味；內容物為黃褐色顆粒，味微苦，顆粒干燥，松緊適度，色澤一致。

2.4.2 水分 取3批枇杷葉膠囊內容物各2份，每份約2 g，按《中國藥典》2015年版相關規定[11]進行檢查，結果顯示均符合要求，見表3。

2.4.3 裝量差異的檢查 從3批枇杷葉膠囊中隨機抽取10粒，按《中國藥典》2015年版相關規定[11]進行檢查，結果顯示均符合要求，見表3。

2.4.4 崩解時限的檢查 取3批枇杷葉膠囊，每批6粒，按《中國藥典》2015年版相關規定[11]進行檢查，結果顯示均符合要求，見表3。

表3 3批枇杷葉膠囊檢查結果

2.5 定性鑒別

2.5.1 供試品溶液制備 取3批枇杷葉膠囊內容物適量，研細，各取1 g，分別加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.2 對照藥材溶液制備 取枇杷葉對照藥材1 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.3 對照品溶液制備 取熊果酸對照品適量，加甲醇制成每1 ml含熊果酸1 mg的溶液，即得。

2.5.4 陰性供試品溶液制備 按處方取輔料1 g，準確稱定，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，即得。

2.5.5 薄層色譜（TLC）鑒別 吸取3批供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、陰性供試品溶液各1 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖1。由圖1可見，供試品、對照品、對照藥材色譜在相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性供試品基本無干擾。

圖1 枇杷葉膠囊TLC鑒別

2.6 含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.5 %醋酸銨溶液（73:12:15）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；理論塔板數按熊果酸峰計算應不低于5000[8]。

2.6.2 對照品溶液制備

2.6.2.1 熊果酸對照品儲備液的制備 取熊果酸對照品適量，加乙醇，制成每1 ml含熊果酸3.080 mg的對照品儲備液。

2.6.2.2 齊墩果酸對照品儲備液的制備 取果齊墩酸對照品適量，加乙醇，制成每1 ml含齊墩果酸1.160 mg的對照品儲備液。

2.6.2.3 混合對照品溶液制備 分別取熊果酸對照品儲備液、齊墩果酸對照品儲備液適量，置于10 ml量瓶中，以乙醇定容，得到含熊果酸1.540 mg/ml、齊墩果酸0.580 mg/ml的混合對照品溶液。

2.6.3 供試品溶液制備 取枇杷葉膠囊內容物適量，研細，取0.2 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.6.4 空白溶液制備 按處方取輔料1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加入乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.6.5 專屬性考察 取供試品溶液、混合對照品溶液及空白溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，按2.6.1項色譜條件進樣檢測，結果見圖2。由圖2可見，齊墩果酸和熊果酸出峰時間適宜，峰形良好，空白溶液無干擾。

圖2 專屬性考察HPLC圖譜

2.6.6 線性關系考察 分別精密吸取熊果酸對照品儲備液和齊墩果酸對照品儲備液各0.625，1.25，2.5，5，10 ml，置20 ml量瓶中，以乙醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，取系列混合對照品溶液各10 μl，按2.6.1項色譜條件進樣分析。以系列混合對照品溶液濃度為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，進行回歸計算，得熊果酸回歸方程y=3048.3x+0.9007（r=0.9999），在濃度為0.096～1.540 mg/ml時線性關系良好；齊墩果酸回歸方程y=4754.9x-17.269（r=0.9998），在濃度為0.036～0.580 mg/ml時線性關系良好。

2.6.7 精密度考察 取供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，連續進樣6次，按2.6.1項色譜條件進樣測定，熊果酸和齊墩果酸峰面積RSD值均為0.40 %，表明儀器精密度良好。

2.6.8 穩定性考察 取供試品溶液，室溫下放置，分別于0，6，12，30，48，72 h進樣10 μl，測得熊果酸和齊墩果酸的色譜峰面積RSD值分別為2.35 %，2.34 %，表明供試品溶液在72 h內穩定性良好。

2.6.9 重復性考察 取供試品溶液 6份，各10 μl，按2.6.1項色譜條件進樣分析。測得熊果酸和齊墩果酸兩者總含量RSD為2.61 %，表明該方法重復性良好。

2.6.10 加樣回收率考察 取已知含量的枇杷葉膠囊內容物9份，研細，稱取0.1 g，精密稱定，置10 ml量瓶中，分為3組，每組分別加入齊墩果酸對照品溶液0.4，0.6，1.2 ml和熊果酸0.8，1.0，1.2 ml，加入乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.6.1項色譜條件測定齊墩果酸峰面積積分值，計算回收率和RSD值。結果見表4、表5。

表4 齊墩果酸加樣回收率試驗結果

表5 熊果酸加樣回收率試驗結果

2.6.11 樣品中熊果酸和齊墩果酸含量的測定 取3批樣品，按2.6.2和2.6.3項下方法分別配制對照品和供試品溶液，每批平行測定3份，測定結果見表6。

表6 樣品中熊果酸和齊墩果酸含量

3 討論

本文通過輔料用量、吸濕性、流動性、成型性對制劑的輔料進行篩選，最終確定選用微晶纖維素、淀粉，兩者配比為1:1；通過堆密度實驗，并依據2015年版《中國藥典》中枇杷葉的使用量進行折算，選定1號空心膠囊進行填充。

因枇杷葉膠囊是枇杷葉的單方制劑，故首選2015年版《中國藥典》枇杷葉藥材項下的方法對枇杷葉膠囊進行鑒定，結果顯示斑點清晰，分離效果好。多次試驗結果表明方法重現性好。

熊果酸和齊墩果酸是枇杷葉中含量最高的三萜酸類成分，而三萜酸是枇杷葉抗炎止咳的主要成分，因此選定熊果酸和齊墩果酸為枇杷葉膠囊的定量指標。采用HPLC法建立了枇杷葉膠囊中熊果酸和齊墩果的含量測定方法，并進行了方法學考察，考察結果表明該方法專屬性好、重現性好、穩定性好、回收率良好。本方法可有效地控制枇杷葉膠囊的質量。

通過上述枇杷葉膠囊的一般檢查（外觀性狀、水分、崩解時限、裝量差異）結果、TLC鑒別方法的確定、含量測定方法的建立及3批樣的含量驗證，為枇杷葉膠囊的質量標準擬定提供了數據支持，同時為枇杷葉膠囊的質量可控提供了保證。