六君子湯相態拆分及表征研究

尚爾雨，馬曉乾，于新，孫爽 *，申國濤*

(1.黑龍江省森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2；黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

湯劑是中藥中最為悠久的劑型之一，可以適應中醫辨證論治的原則，且具備易吸收、療效快、作用強等特點，在中醫的臨床應用中也最為普遍[1-3]。中藥湯劑是一個復雜的分散體系，其有效成分以溶質或分散相在分散介質中形成真溶液、膠體、混懸液和乳濁液等不同分散相態[4-6]。在多種復方中藥湯劑中均觀察到直徑在幾十到幾百納米不等的納米粒子，藥液中的納米粒子可通過氫鍵等方式結合難溶性有效成分來增強其難溶性成分的溶解度，從而增強藥液的療效。對于中藥復方中納米相態等分散體系的研究開展于1970年，一方面是由于當時還沒普及掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、馬爾文納米粒徑儀等表征技術，一方面鑒于當時中藥藥效物質基礎研究還不夠深入，導致不能精準獲取膠體粒子的形態和溶解參數[7]。例如板藍根湯劑經過離心除雜后發現其具有明顯的丁達爾現象，通過相差顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)等手段觀察板藍根湯劑膠體顆粒的形態特征，發現板藍根湯劑膠體中存在粒徑為60～180 nm大小不等的球形和橢球形的納米顆粒組分，并且顆粒不穩定會相互聚集成小丘狀或粘連成串[8]；通過對當歸補血湯主要成分進行分離與表征，在提取液中觀察到明顯的丁達爾現象，還有粒徑在50～100 nm和1 000 nm以上的質點[9-10]。然而，有效成分，尤其是難溶性成分是如何分散到人體中并被人體吸收的，這些都值得我們去深入研究探討。

六君子湯出自《醫學正傳》，為四君子湯加陳皮、半夏而成。作為基礎方加味治療脾胃病證，應用非常廣泛，如脾胃氣虛兼痰濕證、食少便溏、胸脘痞悶、嘔逆等。現代臨床常用于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等屬脾胃氣虛者。試驗研究表明六君子湯藥理作用廣泛，可通過調整細胞因子間的網絡平衡，改善胃腸道的內分泌功能，減輕胃黏膜的炎癥反應，從而發揮對胃黏膜的保護作用。但由于受條件限制，迄今為止，對六君子湯進行深入的分析和研究很少，其研究仍局限于湯劑藥理作用。因此本研究以六君子湯作為研究對象，通過對六君子湯分散體系進行各相態拆分，并對六君子湯中納米相態進行觀察研究，探討納米相態與六君子湯補氣理氣的功效之間的關系。通過研究六君子湯中分散體系的組成，采用透析與超速離心相結合的方法，對六君子湯進行了真溶液相態、納米相態和沉淀相態拆分，并采用TEM、粒徑分析等方法，對其中納米相態進行了表征，以期為后期研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AB265-S分析天平(瑞士Mettler公司)； H-2050R超速低溫離心(湘儀離心機儀器有限公司)；HZS-HA水浴恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)；JEM-2010HR透射電鏡(日本電子株式會社)；Zetasizer Nano-ZS90馬爾文粒徑儀(英國馬爾文儀器有限公司)；I1033透析袋(Biosharp生物科技有限公司)；BJH-W300K電陶瓷鍋(廣東天際電器股份有限公司)。

1.2 藥物與試劑 陳皮、人參、半夏、茯苓、白術、炙甘草，均購于哈爾濱市同仁堂大藥房，以上藥材經黑龍江中醫藥大學藥學實訓教研室呂邵娃教授鑒定為正品，標本存放于黑龍江中醫藥大學藥學院實驗室。EDTA (廣州市化工試劑有限公司，分析純)；NaHCO3(天津市天力化學試劑有限公司，分析純)；試驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 透析袋的預處理 用剪刀將透析袋剪成恰當長度約 20 cm。稱取0.15 g EDTA在超聲作用下溶解于500 mL蒸餾水中，得到1 mmol·L-1EDTA溶液。在超聲的作用下，用NaHCO3調節上述溶液到pH=8。將所得溶液液體分為兩份各250 mL，用于煮透析袋。將透析袋放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。從 EDTA-2Na 液體中取出透析袋，用蒸餾水洗滌干凈。將透析袋再放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。取出，用蒸餾水清洗數次，再將冷卻后的透析袋浸沒于75%乙醇溶液中，存放于4 ℃冰箱冷藏備用。用前，用蒸餾水充分清洗。

2.1.1 六君子湯的煎煮及預處理 六君子湯(Ⅰ)的煎煮工藝為藥材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min，將藥液濃縮至生藥量為0.55 g·mL-1。將六君子湯經 6 000 r·min-1離心 30 min，得沉淀相態(Ⅱ)，所得樣品進行透析-離心處理。

2.1.2 樣品透析-超速離心處理 將六君子湯加至透析袋二分之一處，隨即將透析袋裝入加有200 mL蒸餾水的燒杯中，于水浴恒溫振蕩器 120 r·min-1震蕩30 min，取出透析袋中六君子湯樣品；于 10 000 r·min-1離心30 min，取上清液，上述透析-超速離心操作記為1 次，以此重復5次，取上清液樣品。燒杯中的液體為真溶液相態(Ⅲ)，透析袋中的液體為納米相態(Ⅳ)。

2.1.3 樣品丁達爾現象觀察 將每次透析-離心后的六君子湯樣品分別制成原液、5倍稀釋液、10倍稀釋液3種樣品并進行丁達爾現象觀察，結果見表1、圖1。

表1 透析離心后樣品丁達爾現象

圖1 透析-離心后樣品丁達爾現象

根據以上試驗結果看出六君子湯樣品稀釋10倍丁達爾現象都較為模糊，因此不適合進行下一步試驗。而透析-離心1次的5倍稀釋液，透析-離心2次的5倍稀釋液，透析-離心3次的5倍稀釋液，透析-離心4次的原液及5倍稀釋液、透析-離心5次的原液這些樣品的丁達爾現象較為清晰，可以選取進行TEM觀察。

2.1.4 六君子湯納米相態TEM觀察 用滴管吸取少許制備的六君子湯納米相態滴于支持網(超薄碳膜)上，待干燥后，再滴一次；觀察支持網(超薄碳膜)，若無明顯物體，再滴一滴樣品；TEM 下觀察并拍照。

2.2 試驗結果

2.2.1 透析-超速離心次數與稀釋倍數考察 不同透析-超速離心次數與稀釋倍數所得TEM結果見表2、圖2。

圖2 六君子湯納米相態不同透析-離心次數與稀釋倍數的TEM圖

表2 六君子湯樣品TEM觀察效果

試驗結果表明：由于樣品中淀粉粒較多，因此影響圖像的清晰度，導致圖A、B粒子邊緣不清晰，僅能觀察到模糊的球狀物質；圖C團聚物邊緣不清晰，但是可見明顯的球狀粒子；圖D團狀物聚集，粒子清晰可見；圖E可以看到團狀物聚集，粒子清晰可見；圖F只能看到團狀物，而且邊緣不清晰。由此可知，隨著透析-離心次數的增加與樣品稀釋倍數的增加，樣品里的納米粒更加清晰可見，其中透析-離心4次稀釋5倍的樣品圖像最為清晰，因此選用作為下一步試驗。

2.2.2 室溫放置時間考察 將于室溫放置 0、8、24 h 后的透析-離心4次稀釋5倍的六君子湯納米相態樣品，按照上述制片步驟進行制片，進行TEM觀察并拍照，結果見表3、圖3。

表3 樣品放置時間與TEM觀察效果

圖3 六君子湯納米相態放置不同時間的TEM圖

試驗結果表明：圖A圓球狀粒子清晰，可見粒子外面包裹的保護層，粒子內的物質可清晰看清，圖像效果好；圖B可見連續的葡萄狀粒子，粒子外面包裹的保護層與粒子內的物質雖然能看清，但較圖A模糊；圖C可見團狀物，團狀物內可見粒子，但是粒子較為模糊，粒子聚集。因此表明樣品室溫下放置0 h，TEM圖像最為清晰。

2.2.3 最優方案的六君子湯納米相態TEM觀察 TEM下觀察結果表明，六君子湯樣品中存在納米顆粒，結果見圖4。

圖4 六君子湯納米相態TEM圖

2.2.4 六君子湯納米相態的粒徑分布及其電位大小 利用馬爾文粒徑儀對六君子湯納米相態的粒徑大小及其分布進行測定。在室溫條件下，取適量的六君子湯納米相態溶液，加入粒徑儀的樣品管中進行分析。試驗結果表明，粒徑主要集中在100 nm，此外，還存在少量粒徑大于100 nm的粒子。上述結果與TEM結果相互吻合，結果見圖5A。

利用馬爾文粒徑儀對六君子湯納米體系進行電位測定。在室溫條件下，取適量的六君子湯納米相態溶液，置于粒徑儀的微電泳池中進行分析，并記錄數據。試驗結果表明，六君子湯納米相態的電位為-2.22～-1.97 mV，說明體系不穩定，這可能是由于體系中出現不同程度的團聚造成的，結果見圖5B。

A.粒徑強度分布圖；B.Zeta電位分布圖圖5 六君子湯納米相態的表征

3 討論

前期文獻研究表明，使用超薄碳膜作為支持網、透析袋作為拆分介質，有利于中藥湯劑中納米相態的拆分。因此，本試驗在以上兩個方法的基礎上，利用丁達爾現象初步判斷六君子湯中是否存在納米相態，并對樣品透析-離心次數、稀釋倍數以及樣品放置時間進行了考察。本試驗通過對六君子湯中的相態拆分進行分離與表征，從六君子湯中發現了納米粒，并以分離的納米粒子的形態為評價指標，對透析-超速離心次數(1 次、2 次、3 次、4 次及 5 次)，樣品稀釋倍數(0倍、5倍、10倍)，樣品溶液室溫放置時間 (0、8、24 h)等方面進行考察，優化了拆分工藝，最終確定透析與超速離心4次，樣品稀釋5倍，室溫放置0 h的拆分工藝。按照最佳拆分工藝制備六君子湯納米相態3批，考察各批次六君子湯納米相態及TEM形態。結果表明，納米相態中存在納米顆粒，TEM圖像清晰可見球狀團聚物，圖像良好，說明該拆分工藝的重現性良好，工藝可行。

有研究報道，中草藥水煎液中存在納米聚集體，盡管它們的藥理學性質和生成機理仍然是未知的，但是納米聚集體的存在提示我們中藥湯劑可能是通過納米相態來實現增溶。從六君子湯配伍增效角度來看，難溶性成分(人參中的人參皂苷、茯苓中的茯苓酸、陳皮中的黃酮)的溶出度增大，推測白術和甘草中的植物性多糖、根莖成分中所含的無機物質、甘草中的甘草酸(表面活性物質)在整個湯劑的形成過程中，應該各自扮演著不同的角色，從而形成了一種天然的納米相態。但是該體系的存在及機制尚不明確，推測六君子湯中納米相態的大分子物質形成核-殼結構，于TEM圖中觀察到類似結構，有待于今后科研工作的進一步證實。