實時熒光PCR 檢測腹瀉患者腸致瀉性大腸桿菌的分布情況研究

劉蘊博

大腸埃希氏菌,通常又將其稱為大腸桿菌,是人類動物腸道中普遍存在的正常菌群,但是部分血清型大腸桿菌也可導致腹瀉發生。根據其臨床特點、發病機制以及流血病學等特征,可將致瀉性大腸桿菌分為腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌等五種類型［1］。其中腸致病性大腸桿菌可導致嬰幼兒或5 歲以下兒童發生腹瀉；腸出血性大腸桿菌具有普遍易感性,尤其多發于老年人和兒童；腸產毒性大腸桿菌不論是對成人,還是對小孩,均可導致其發病；腸侵襲性大腸桿菌可導致成人或大齡兒童出現菌痢樣腹瀉,腸黏附性大腸桿菌與小兒頑固性腹瀉具有較大關系［2］。為了解腸致瀉性大腸桿菌在腹瀉患者中的分布情況,本文應用實時熒光PCR 檢測技術對其展開了如下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年10～12 月期間檢查的150 例腹瀉患者糞便標本為研究對象,其中男82 例,女68 例。所使用儀器包括實時熒光PCR 儀、高速離心機、恒溫培養箱；培養基使用GN 增菌液,檢測試劑包括腸產毒性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌實時熒光診斷試劑盒。

1.2 方法 采集糞便標本后,首先使用GN 增菌液對其進行增菌處理,然后采集增菌液1 ml,以13000 r/min的速度對其進行離心處理,離心2 min 后去掉上清,將100 μl 的DNA 提取液充分混勻后,置于沸水中對其進行水浴,10 min 后再次以13000 r/min 的速度離心5 min,采集上清液作為實時熒光PCR 反應的模板DNA,然后應用實時熒光PCR 反應體系和擴增程序對其進行相應操作。

2 結果

2.1 檢出情況分析 150 例腹瀉糞便樣本中,共檢出致瀉性大腸桿菌36 例,總檢出率為24.00%(36/150)。其中檢出腸致病性大腸桿菌18 例,占比50.00%,腸黏附性大腸桿菌12 例,占比33.33%；腸出血性大腸桿菌3 例,占比8.33%；腸產毒性大腸桿菌2 例,占比5.56%,腸侵襲性大腸桿菌1 例,占比2.78%。見表1。

表1 36 例致瀉性大腸桿菌分布情況分析(n,%)

2.2 患者不同時間及年齡段的病原菌檢出情況分析10 月致瀉性大腸桿菌的檢出率為25.93%,11 月和12 月致瀉性大腸桿菌檢出率分別為26.00%和19.57%,以11 月檢出率較高。從年齡分布情況來看,<5 歲患者的致瀉性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌檢出率相對較高。見表2。

表2 150 例患者不同時間及年齡段的病原菌檢出情況分析［n(%)］

3 討論

腹瀉是一種臨床常見疾病,在各類細菌性傳染病中,感染性腹瀉所占比重較大,可對患者生活質量造成較大影響［3］。有研究學者采用傳統分離培養及分子生物學檢測技術對致瀉性大腸桿菌的分布情況進行調查研究發現,我國致瀉性大腸桿菌主要有五種較為常見的類型,其中腸致病性大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌均較為常見［4］。

本研究結果顯示,150 例腹瀉糞便樣本中共檢出致瀉性大腸桿菌36 例,總檢出率為24.00%,其中檢出腸致病性大腸桿菌占比50.00%,腸黏附性大腸桿菌占比33.33%；腸出血性大腸桿菌占比8.33%；腸產毒性大腸桿菌占比5.56%,腸侵襲性大腸桿菌占比2.78%。腹瀉患者的致瀉性大腸桿菌以腸致病性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌為主。據資料報道,80 年代在各類腸致瀉性大腸桿菌中,以腸產毒性大腸桿菌為主,其次為腸致病性大腸桿菌［5-8］,由此可見,我國的致瀉性大腸桿菌分布情況已經發生了較大改變。通過對本研究所選病例的不同時間的分布情況來看,11 月份的致瀉性大腸桿菌檢出率相對較高,體現了細菌性腹瀉多發于夏秋季的流行病原學特性。<5 歲患者的致瀉性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌檢出率相對較高,說明該類病原菌是導致兒童腹瀉的重要原因,與相關文獻報道一致［9］。腸黏附性大腸桿菌與小兒頑固性腹瀉具有較大關系,目前對于該類病原菌主要采用分子生物學手段進行鑒定［10］,本研究運用實時熒光PCR 技術對其進行檢測,敏感性高于傳統的分離培養技術,但各相關致瀉性大腸桿菌的檢出率仍然較高,分析其原因可能在于：①衛生環境改善和生活水平的提高,極大地改善患者生活條件,可降低患者的腹瀉病發病率；②本研究所選樣本量較少,且所選取的時間段較窄,無法較為全面的反應腹瀉患者的病原菌分布情況,且所采集數據無法反映全年情況［11］；③糞便標本采集是否規范、標本保存及送檢條件,是否在服用抗生素前采樣等,都可能影響檢出結果的可靠性。

總而言之,實時熒光PCR 是目前病原菌診斷較普及的分子生物學技術,具有耗時短和操作簡單等優勢,且在敏感性和特異性方面明顯優于常規PCR,是當前診斷腹瀉患者各種病原菌分布的首選方法。在病原菌數量處于常規分離培養的檢出限以下時,利用分子診斷方法能夠獲得較為準確地檢測結果,但隨著實時熒光PCR 技術的推廣,該技術在致瀉性大腸桿菌就其他病原菌檢測中發生了極為重要的作用,可進一步推廣應用該方法。