黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1基因表達的影響

王曉慧，宮銘海，楊波，鄭向群，劉寧，周忠光*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農業綜合開發股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150323)

肝臟疾病已經成為臨床常見疾病之一，對人類健康產生巨大的威脅。肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是多種慢性肝病發展的必經階段，肝細胞具有很強的再生能力，當肝細胞受到損傷之后，會發生炎癥反應和代償性的修復反應，出現細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)的沉積，如果損傷因素持續存在，會導致細胞外基質過量沉積從而引起肝纖維化，如果沒有得到有效的干預，肝纖維化程度會持續加重，很快轉化為肝硬化甚至肝癌[1-2]。延緩或控制HF的繼續發展，甚至逆轉HF，使患者肝臟的組織結構與相應的功能得以提高或恢復，減少惡性肝臟疾病的發生，一直是醫學工作者努力的目標[3-4]。

黃精在我國是一味常用的補益良藥，古代醫書記載其有補氣養陰、養肝健脾益腎等功效[5]，同時也是一種保健食品，唐代就流行服食黃精來強健身體、保持容顏[6]。現代研究認為，黃精具有保護肝臟、抗菌消炎、降脂、降糖等多種藥理作用[7]，本文通過建立多種因素聯合誘導的大鼠肝纖維化模型，觀察黃精對大鼠肝臟的保護作用，并對其作用機制進行初步探討。

1 實驗材料

1.1 主要藥品與試劑

黃精提取液(西安天瑞生物技術有限公司，生藥量10 g/mL)；四氯化碳(天津市大茂化學試劑廠)；牛欄山二鍋頭；4%多聚甲醛固定液(福州飛凈生物科技有限公司)；水合氯醛(天津市天力化學試劑有限公司)；HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TGF-β1、ICAM-1 ELISA法測定試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)；Trizol Reagent(Invitrogen)；異丙醇(分析純)；三氯甲烷(分析純)；DEPC水；逆轉錄酶(Promega)；RNase抑制劑(TOYOBO)；dNTPs(Sangon)；Taq DNA聚合酶(TAKARA)。

1.2 實驗動物與耗材

48只SPF級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證編號:SCXK(黑)2018-001。適應性飼養、造模和給藥過程均在黑龍江中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室完成，實驗室溫度為20～24 ℃，相對濕度45%～55%，換氣量11～13次/h。標準飼料、清潔飲用水由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，高脂低蛋白飼料在79.5%標準飼料基礎上添加20%豬油和0.5%膽固醇。

1.3 主要儀器與設備

2135型組織切片機(德國徠卡)；TD5AWS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；Motic BA210顯微鏡(廈門麥克奧迪實業集團有限公司)；Moticam3000顯微攝影成像系統(美國Motic)；RT-6100酶標分析儀(深圳生命科學股份有限公司)；熒光定量PCR儀(美國stratagene公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 動物分組、模型的建立以及給藥

40只大鼠在實驗室適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為4組：正常對照組、模型組、黃精中劑量組(10 g/kg)、黃精高劑量組(15 g/kg)，每組10只，正常對照組大鼠自由進食標準鼠糧、飲用清潔水源，其余各組大鼠采用聯合誘導方法建立大鼠肝纖維化模型，即喂養高脂飼料，以20%酒精作為唯一飲用水源，將40% CCl4溶于橄欖油內，在頸后進行皮下注射(第一次注射劑量為0.5 mL/100 g,以后每隔3 d注射1次，劑量為0.3 mL/100 g)，模型建立期6周。第6周末隨機選取3只大鼠處死，摘取肝臟制作病理切片，觀察確認造模成功后，黃精中、高劑量組給予相應劑量黃精灌胃治療，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，持續6周。最后一次灌胃給藥后不再給予飼料，但仍可飲水，次日麻醉后進行取材。

2.2 組織切片的制作

大鼠麻醉后，開腹摘取肝臟，經生理鹽水漂洗后，在肝臟左葉同一部位取材，經甲醛溶液固定48 h后，按照常規操作步驟依次進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片，按HE染色試劑盒染色后，在光鏡下觀察肝臟組織結構的變化。

2.3 ELISA法測定血清TGF-β1、ICAM-1含量

大鼠麻醉后，用真空采血管自腹主動脈取血置于抗凝管內，室溫下靜置1 h后，放入離心機3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作，檢測各組血清中TGF-β1、ICAM-1的含量。

2.4 肝臟TGF-β1、ICAM-1基因表達水平的測定

漂洗后的肝臟，在肝臟右葉同一部位取組織塊放入凍存管內，經液氮轉移至-80 ℃冰箱凍存備用，經RT-PCR檢測肝臟TGF-β1、ICAM-1基因表達水平的變化。

TGF-β1、ICAM-1及內參引物均由上海艾博思生物科技有限公司設計。GAPDH引物序列為：上游5′-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′，下游5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3′，總長度206 bp；TGF-β1引物序列為：上游5′-CATGGAGCTGGTGAAACGGAAG-3′，下游5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′，長度74 bp；ICAM-1引物序列為：上游5′-GCCATACGTACCCTGTCGTC-3′，下游5′-5GGAAGCTGGACAGCCAGGC-3′，長度115 bp。肝臟組織總RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測定RNA的濃度和純度，確定提取的總RNA質量較好后，逆轉錄為cDNA，進行熒光定量PCR檢測。反應條件為95 ℃，3 min變性；94 ℃，20 s，62 ℃，40 s，共40個循環。對實驗所得數據進行分析，mRNA表達的相對水平=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT指其余樣品的ΔCT值和對照樣品相應基因的ΔCT值之差。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠肝臟組織結構的影響

HE染色結果可見，如圖1所示，正常組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列成條索狀，以中央靜脈為中心向四周放射狀排列，肝細胞輪廓清晰，未見脂肪變性和炎細胞分布；模型組大鼠肝小葉結構被破壞，小葉間可見大量粗條狀結締組織增生，肝細胞腫脹壞死，可見彌漫性脂肪變性和炎細胞浸潤；黃精中、高劑量組大鼠肝臟病變明顯減輕，脂肪變性明顯減少，近乎消失，炎細胞浸潤區域減少。

圖1 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠肝臟組織結構的影響(HE染色，×400)

3.2 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平的影響

ELISA結果顯示，如表1所示，模型組大鼠血清與正常組相比TGF-β1、ICAM-1水平顯著提高(P<0.01)，而黃精治療組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平比模型組顯著下調(P<0.01)。

表1 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平的影響

3.3 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1基因表達水平的影響

RT-PCR結果顯示，如表2所示，模型組大鼠與正常組相比TGF-β1、ICAM-1基因表達水平有顯著提高(P<0.01)，而黃精治療組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平比模型組顯著下調(P<0.01)。

表2 黃精對聯合誘導肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1 mRNA表達水平的影響

4 討論

現代生活環境中，多種因素如高脂飲食、大量飲酒、化學性藥物、病毒、炎癥、毒素和自身免疫性疾病的累加，都會造成肝細胞損傷，長期持續發展可以轉變為脂肪肝、肝硬化(liver cirrhosis，LC),甚至肝癌等眾多肝臟疾病。在眾多慢性肝病的發生發展進程中，肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是一個必經環節[8]。如果沒有得到有效的干預，肝纖維化程度會持續加重，很快轉化為肝硬化甚至肝癌?，F代研究已經證實，當病程發展至肝硬化階段時，已經很難治愈，而在肝纖維化階段，則是可以逆轉的[9-10]。因此，如何預防肝纖維化，延緩肝纖維化發展，尋找抑制肝纖維化發展過程中的可能靶點，是治療慢性肝病，防止肝硬化甚至肝癌出現的重中之重。

在肝纖維化的形成過程中，有眾多因子和信號轉導通路參與其中，ICAM-1是一種細胞黏附因子，在肝損傷因素作用下會大量表達，參與肝細胞的炎癥反應，導致肝損傷的發生[11-12]；TGF-β1是纖維化進程中發揮重要作用的細胞因子之一，與肝纖維化程度密切相關，研究發現TGF-β1可以促進肝星狀細胞的增殖，并促使其分化為肌成纖維細胞，使細胞外基質生成增加；同時抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的產生，并促進組織抑制因子(TIMP-1)的生成，從而使得細胞外基質的降解量減少，細胞外基質的生成大于降解，導致細胞外基質大量沉積，引起肝纖維化[13-16]。本研究顯示，模型組大鼠肝纖維化明顯，血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1表達顯著升高，提示細胞黏附引發的炎癥反應以及肝星狀細胞的增殖活化是肝纖維化發生過程中的重要因素；而黃精治療組大鼠的肝纖維化程度有明顯減輕，且血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1表達明顯降低，說明黃精對肝纖維化模型大鼠的肝臟有保護作用，該保護作用可能與其抑制了血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1的表達，從而減輕了炎癥反應，減少細胞外基質的生成有關。