OX40 對2 型糖尿病患者外周血黏膜相關恒定T 細胞的調亡作用及意義

張梅，陸文敏，鐘國權，徐令清，吳永堅

（1.廣州醫科大學附屬第六醫院清遠市人民醫院，廣東 清遠 511518；2.廣州醫科大學廣州婦幼醫療中心，廣東 廣州 510120）

0 引言

糖尿病患者持續性的高血糖會導致自身免疫細胞含量的改變甚至變異，以往實驗已證實，由多種免疫和炎癥性疾病導致免疫穩態失衡的重要因素是T 細胞功能失常[1,2]，其可能是T 細胞過度活化釋放了大量炎性細胞因子并誘導炎性反應以及引起自身免疫應答，同時還釋放相應的細胞因子并參與糖尿病進展[3-4]。然而，黏膜相關恒定T 細胞（mucosal associated invariant T cells，MAIT 細胞）的作用和機制依然不清楚。本研究擬探討2 型糖尿病病人（T2DM）MAIT 細胞上OX40 的表達水平及OX40 促進活化誘導T2DM 中MAIT 細胞凋亡作用[5,6]，進一步討論OX40 對MAIT 細胞的免疫調控在2 型糖尿病發病中的作用，為靶向OX40+MAIT 細胞可能是治療T2D的一種有前途的方法提供新的數據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2019 年8 月于廣州醫科大學附屬第六醫院清遠市人民醫院治療的51 例2 型糖尿病患者作為2型糖尿病組（T2DM），其中男27 例，女24 例，年齡22～82 歲，年齡（55.6±9.2）歲；所有T2D 患者臨床表現為高血糖，診斷及分型依據按照2010年WHO 標準執行。另取性別和年齡相匹配的標準化OGTT 試驗結果無異常的健康成年志愿者44 名為健康對照（HC）組，其中男19 例，女25 例，年齡24～76 歲，年齡（54.2±10.3）歲。

1.2 試劑與儀器

細胞固定液、滲透緩沖液和破膜劑均購自美國eBioscience 公司，單克隆抗體購自美國BD 生物科學、Biolegend 公司。流式細胞分析采用美國BD 公司LSRFortessa 型流式細胞儀。

1.3 檢測方法

流 式 細 胞 術 檢 測OX40、CD3、TCRVa7.2+、CD45RO、CD8、CD69 和Fas 指標的表達。采用BD 磁珠分離系統分離出TCRVa7.2+細胞亞群（MAIT 細胞）；檢測外周血分離的MAIT 細胞中caspase-3 的表達。

1.4 數據分析

采用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料數據用（）表示，組間率的比較采用卡方檢驗，P<0.05 有統計學差異。

2 結果

2.1 T2D 病人外周血MAIT 細胞數量減少

流式檢測外周MAIT 細胞的比例，結果見表1,T2D組的MAIT 細胞比例明顯低于HC 組。進一步采用流式分析OX40 在MAIT 細胞的比例，結果為T2D 組的MAIT 表面OX40 比例明顯高于HC 組，表達增加，結果見表1。

表1 OX40 及MAIT 細胞的比例

2.2 CD45RO、CD69 和Fas 在OX40+組中增加

進一步分析OX40 陰性和陽性兩個亞群在MAIT細胞中以下指標的表達，發現OX40-的MAIT 細胞表面效應分子CD45RO 的比例顯著低于OX40+組；在OX40-細胞中的活化分子CD69 和死亡受體Fas 的平均熒光強度顯著低于OX40+組，差異有統計學意義，結果見表2。

表2 OX40 在MAIT 細胞上表達與活化

2.3 HC 組OX40 和MAIT 細胞數量有顯著相關性

采用SPSS 24.0 軟件分析OX40 表達與MAIT 細胞數量的相關性發現，HC 組OX40 和MAIT 細胞數量有顯著相關性(r=-0.53),T2D 患者的呈強負相關（r=-0.61）,差異都有統計學意義，結果見圖1。

圖1 OX40 表達與MAIT 細胞頻率相關性分析

2.4 MAIT 細胞在T2D 疾病中凋亡比例增高

T2D 患者的MAIT 細胞分裂的caspase-3+比例明顯高于正常對照組(n=20；與健康對照組(n=20；6.82±0.606%；P<0.001；圖2A)，提示MAIT 細胞在T2D 疾病中凋亡比例較高。與OX40-(13.6±0.771)相比，OX40+MAIT 細胞分裂caspase-3+(22.8±1.41%)明顯增加；P<0.001；圖2B)，說明OX40 參與了T2D 患者MAIT 細胞的凋亡，與其MAIT 細胞循環頻率降低密切相關。

圖2 MAIT 細胞中裂解 caspase-3 的表達圖

3 討論

MAIT 細胞產生于胸腺，是一類進化保守的固有樣T 淋巴細胞,并在胸腺重排其相對固定的鏈序列，其表型7.2+CDl61+，CD161 表達有利于MAIT 細胞趨向外周黏膜組織[7]。T2D 患者外周血中存在著多種不同于健康人群的淋巴細胞亞群，而其不同的亞群含量變化可以反映患者相應的免疫功能狀態變化，通過分析其含量可以在一定程度上了解患者的免疫狀況[8]。在本研究中，T2D 組的MAIT 細胞比例低于HC組，MAIT 細胞可能對T2D 有保護作用。OX40 在T 細胞上具有廣泛的表達以及調控功能，是TNFR 超家族成員之一，其共刺激信號作用巨大，是T 細胞活化和增殖所不可缺的第二信號[9]。本研究發現，在T2D患者的MAIT 細胞上OX40 的表達明顯高于健康對照組，血糖升高后可能通過促進機體的正性共刺激分子從而影響T 細胞的免疫應答[10]。本研究首次證實在MAIT 細胞上表達，參與T2D 的免疫調控作用,OX40在人MAIT 細胞中廣泛表達，尤其在T2D 患者中顯著。有趣的是，OX40 的表達與MAIT 細胞的產生成反比。我們推測OX40 可能在T2D 患者MAIT 細胞含量的改變中發揮著重要作用。在T2D 患者中觀察到MAIT 細胞頻率下降，OX40+細胞數量的增加可能與2 型糖尿病的慢性炎癥程度有關[11]。

研究發現，在T2D 患者MAIT 細胞上CD45RO OX40+記憶表型含量明顯高于CD45RO OX40-；表面分子CD69 OX40+表型含量明顯高于CD69OX40-、FasOX40+表型明顯含量高于FasOX40-，在兩組人群中的差異明顯[12]。CD45RO+T 細胞是具有自我更新能力的記憶T 細胞，可以維持機體免疫記憶功能以及參與再次免疫應答，不但是多能細胞，而且是T細胞的重要亞型，在許多疾病(包括糖尿病)的發生發展過程中可能起著重要的作用。現有的研究認為，CD45RO+T 細胞當其再次接觸相同的抗原后會快速活化以及增殖，并釋放Thl 類如IL.2、IL.4 等細胞因子，加助B 淋巴細胞合成和分泌IgG 抗體來增強機體的免疫功能[13-14]。實驗中T2D 患者的CD45RO OX40+T 細胞比例明顯增高，提示其在糖尿病的免疫中起著重要作用，其細胞比例高低與糖尿病病情進展有著較密切的關系。此外，與OX40-MAIT 細胞相比OX40+MAIT 細胞群體中存在高度顯著的死亡受體Fas。CD69 和Fas 在OX40+MAIT 細胞中的平均熒光強度(MFI)明顯高于OX40-MAIT 細胞，實驗表明OX40+MAIT 細胞可能是T2D 患者激活T 細胞的一個子集，當其被激活可以表達大量的死亡受體Fas。我們發現，在T2D 組OX40+MAIT 細胞表達的表面Fas 受體和細胞內裂解的caspase-3 水平高于OX40-亞群[15-16]。OX40 與OX40L 重組蛋白激活可誘導MAIT 細胞凋亡，提示OX40 誘導的細胞死亡可降低T2D 患者外周血中MAIT 細胞的頻率。我們發現OX40 在T2D 患者的MAIT 細胞中上調，并通過caspase-3 促進細胞凋亡。本研究發現MAIT 細胞的比例與其上OX40 的表達呈負相關，因此推測OX40 能通過調控MAIT 細胞在抗糖尿病中發揮重要作用。

綜上所述，本研究發現T2D 患者中MAIT 細胞比例下降，其表面的OX40 分子表達明顯上調，其比例與OX40 的表達呈反比，OX40 通過caspase-3 促進MAIT 細胞凋亡，這些發現拓寬了我們對OX40 的認識，我們的研究結果為T2D 期MAIT 細胞的活化和調控提供了新的思路，為靶向OX40+MAIT 細胞可能是治療T2D 的一種有前途的免疫方法提供了新的數據。