微生物菌種篩選技術方法研究進展①

榮 楠，李 備，唐昊冶，林先貴，馮有智*

(1中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2中國科學院長春光學精密機械與物理研究所，長春 130033；3長春長光辰英生物科學儀器有限公司，長春 130033)

完整地認識地球微生物群落在生物圈和人類健康中的作用，是解決21世紀人類社會從能源、傳染病到農業等諸多領域所面臨許多難題的關鍵[1-3]。2015年，《Nature》呼吁啟動“國際微生物組計劃”，幫助人類全面認識地球環境中微生物群落的數量與功能，為解決上述問題提供了關鍵資源[3]。但隨著研究的深入，越來越多的學者認識到基因組水平、蛋白質組學以及代謝組學層面的研究只能獲得統計學上的相關性結果，缺乏因果性結論，其最核心問題在于缺乏菌種的驗證性實驗。因此菌種篩選被日益推到了學科的前沿，獲取目標微生物后進行因果性的驗證實驗有助于科學家得到最直觀準確的結論，進而推動相關科學發展及其在實際應用方面的進步。

實際上，科研工作者一直致力于篩選菌種。1996年，Rainey和Bailey[4]從英國牛津大學農場種植的甜菜葉子表面分離出的假單胞菌SBW25除了用于研究微生物–植物–土壤相互作用外，已成為研究進化過程的重要模式生物。2006年，Chen等[5]從臺中市一處未經種植地區的土壤中篩選出了36株溶磷細菌，并獲得其分泌的3種新型有機酸，為用于田間的磷酸溶解劑提供了更多選擇。2015年，Yadav等[6]從印度喜馬拉雅山西北部寒冷沙漠采集的不同樣本中篩選出了232種細菌，豐富了人類對寒冷高海拔棲息地菌種組成的認識。同年，Daims等[7]從俄羅斯一口石油探井管壁上生長的微生物膜中培養分離出能一步完全硝化的微生物菌株，打破了科學家125年來認為銨根硝化需要兩類微生物協作的認知。除了推動科學發展外，菌種篩選也解決了很多重大實際問題。2015年，諾貝爾生理學或醫學獎獲得者之一——日本科學家大村智于1974年從土壤中分離到一株鏈霉菌，通過與美國Merck公司合作，發現該鏈霉菌生產的二氫衍生物 Ivermectin可制成藥物用于徹底防治盤尾絲蟲癥(河盲癥)和淋巴絲蟲病(象皮病)[8-9]。1989年，Robertson等[10]報道了好氧反硝化細菌和好氧反硝化酶的存在，為生物脫氮技術提供了一種嶄新的思路。2002年，Dean-Ross等[11]從大卡盧梅特河的沉積物中分離出兩種能使多環芳烴降解的細菌(分枝桿菌和紅霉菌)，推動了生物修復工業污染物用地的進展。2009年，Hong等[12]從中國的8個紅樹林中篩選出與抗癌和抗感染相關的金黃色葡萄球菌等，為新藥物的研發提供了可能性。2018年，Mitra等[13]從印度某鋼鐵廠附近水稻田的土壤中篩選到了有重金屬抗性的S2菌株，為后續研究重金屬污染農業土壤的生物修復奠定了基礎。以上成果極大地推動了醫學、工業和環境工程等領域的進步，同時也表明了純菌株的分離具有極為重要的意義，應在未來的微生物研究中得到重視。

綜上所述，獲取純菌株的微生物分離培養技術是微生物學和微生物研究相關學科的核心內容。地球上棲息著多樣性豐富的生物資源，而人類對這些資源的認知和開發僅是冰山一角，定向發掘微生物功能對人類社會發展具有不可估量的意義[14]。基此，本文擬對當前國內外主流的微生物菌種篩選技術方法進行介紹，并闡明各自的優缺點，以及針對該領域未來發展方向提出些粗淺的看法，拋磚引玉。

1 傳統方法及其優缺點

傳統微生物篩選方法的主要思路為先培養后篩選，即先選擇合適的培養條件(例如培養基、培養環境等)篩分環境樣品中的目標微生物，再從中挑選[15-16]。傳統篩選方法能夠獲得純菌株，了解目標微生物的種水平、基因組和性狀，并使用純菌株進行后續驗證性實驗。雖然該方法經過多年的發展與完善已形成較為成熟的體系，但仍存在兩個無法避免的問題。

首先，當目標微生物的豐度很低或生長十分緩慢時極易被忽略。許多微生物，尤其是寡營養微生物的生長十分緩慢，需要較長的培養時間。只有抑制或降低群落中生長較快菌株的生長和豐度，才有可能篩選出此類細菌。例如，2005年Davis等[17]將土壤細菌置于黑暗條件下的聚乙烯袋中密封培養長達3個月，發現菌群數量持續不斷增加，且之前難以分離出的菌株獲取率也隨著時間的推移而增加。2009年Song等[18]通過在黑暗低溫條件下長達6個月的培養實驗，成功從西太平洋海水樣品中分離出滯后期較長的SAR11菌株。2005年Tamaki等[19]提出細菌的生長也可能受到混合培養中其他細菌釋放的細菌素或培養基內抗菌物質的抑制。

其次，培養基的養分條件和菌株的原生環境差異大，導致目標微生物無法存活。例如，傳統篩選方法使用的培養基大多富含營養物質，這類培養基利于生長較快的細菌，但適應貧乏營養環境及生長緩慢的菌種可能受到抑制[19]。2002年Connon和Giovannoni[20]發現使用稀釋營養物質的培養基能成功培育出以前不可培養的水生和陸生細菌。但上述解決方法仍費時費力，有待進一步改進。2005年Kopke等[21]調查了不同基質和培養條件對潮汐沉積物中細菌生長的影響，發現不同的培養方法會分離出其特有的細菌，證實了培養條件對菌種的影響。2007年Kim[22]發現許多細菌的生長依賴于某些信號分子，而信號分子只存在于自然棲息地中。當此類細菌面對缺少信號分子這一生存要素的培養基時，可能會選擇一種暫時進入低代謝活動狀態的生存策略，從而無法在培養介質上增殖并形成菌落[22-23]。由于上述情況，傳統的平板篩分方法獲得的菌種數量和多樣性很低，無法滿足農業生產、環境治理、醫療衛生等領域的需求。

2 新技術方法及其應用

新的微生物篩選技術方法的思路主要為先篩選后培養，可以有效規避傳統方法的劣勢。而該思路的實現主要歸功于從復雜樣本中識別及分離單個微生物細胞技術的進步、計算方法和成像技術的改進，以及用于數據解析的生物信息學工具的革新。這些技術的發展極大提高了微生物學家篩分微生物的成功率，并減少了人力成本。下面將簡單介紹幾種技術方法。

2.1 基于光學鑷子結合拉曼光譜的細胞分選技術

光學鑷子結合拉曼光譜(laser tweezers and Raman spectroscopy，LTRS)是一種新興的細胞篩分技術。其中，光學鑷子是建立在光輻射壓原理上，采用高度聚焦的激光束提供引力或斥力，從而以物理方式固定和移動微觀中性物體的技術[24]；拉曼光譜則是1928年被印度物理學家Raman所發現[25]，它蘊含著細胞在特定生理狀態下豐富的生化信息，如核酸、蛋白質、脂質等，可作為 “化學指紋”用于描述細胞的分子組成、生理狀態和生態功能[26]。二者相結合則可實現無標記檢測、區分及分選單細胞[27-28]。

2007年黃超等[29]提出將LTRS技術與微流控芯片結合檢測紅細胞的拉曼光譜，發現二者結合后檢測更為準確、快速。2009年，Huang等[27]應用LTRS識別毛細血管中的細胞，再通過毛細血管將其分選，為LTRS技術用于細胞分選提供了可能性。2015年，Berry等[28]利用重水(D2O)的穩定同位素(D)探測來快速識別小鼠盲腸菌群的活性微生物，明確了樣本中兩種主要微生物的活動模式并發現了不明細菌。該研究證明拉曼–FISH預篩選的應用，可在一定程度上解決因目標細胞尺寸小和易損性而導致的手動LTRS分選過程慢等問題，進而使LTRS技術能用于篩分復雜樣品的菌種。2016年Casabella等[30]為了提高細胞分選率，將LTRS技術與微流體芯片結合，該應用使單個細胞能自動被捕獲并通過拉曼檢測分析，大大節省了人工成本。

LTRS技術在實際應用方面仍存在兩個問題。首先，高通量LTRS技術的實現依賴于結合微流體技術，而該技術需將樣品細胞懸浮于溶液中進行操作。但許多樣本中細胞分布在生物膜、沉積物、土壤及人/動物糞便中，上述復雜樣品中的大顆粒物質或碎屑易堵塞微流體設備中的噴嘴和通道，使得操作十分困難[31]；其次，另一個待解決的問題是激光對細胞的損傷，特別是一些反應中心對光損傷敏感的光養生物。光損傷效應取決于波長，現已發現經735、785、835 nm的輻射會不可逆地抑制微藻Trachydiscussp.的光化學活性；而功率為25 mW的885、935和1 064 nm的激光則無不利影響[32]。此外，激光對非光養細胞也有不利影響，例如能量為0.36 J的1 064 nm激光鑷子會影響大腸桿菌的細胞分裂，能量為0.54 J時會影響細胞生長[33]。上述兩個問題該如何解決將成為LTRS技術能否廣泛應用的關鍵。

2.2 熒光活化細胞分選法

熒光活化細胞分選法(fluorescence-activated cell sorting，FACS)是一項新型的、發展迅速的細胞分析技術。其原理是采用激光束激發懸浮在液流中的單行細胞或生物顆粒，探測其熒光及散射光，從而完成對細胞物理和生化特性的高度定量分析與分選[34-35]。流式細胞儀(flow cytometer, FCM)就是以FACS為核心的儀器。它因具有測量指標多、檢測速度快、分選純度高等優點，而被廣泛應用于臨床醫學、細胞學、環境檢測等領域的科學研究和實際應用中。它在新興的生物技術(如系統生物學，稀有細胞檢測或干細胞分離)方面也有巨大的潛力[36]。

1979年，Parks等[37]就已證明只要有熒光信號，即使特異性標記抗原結合細胞在樣品中含量極少，也可用FACS將其分選出。1988年，Webster等[38]提出FACS的獨特能力可使細胞在培養時間最小化的同時產量最大化，從而使得科學家可分析研究在體外壽命極其有限的成肌細胞。2009年，蔡海英等[39]證明FACS可應用于體外培養的兔角膜緣上皮細胞的SP細胞分離，且分離出的細胞具有較強的增生能力。2015年，Lawson等[40]利用高敏感度FACS分析并分選到小鼠的原發性腫瘤細胞和轉移性細胞，推進了對轉移性疾病的預防及治療策略的開發。2018年，金鑫等[41]利用多參數FACS研究發現慢性粒單核細胞白血病(CMML)和反應性增多的單核細胞的免疫學分型結果存在較多差異，綜合這些鑒別點可輔助區分二者，對CMML 的診斷具有重要意義。

FACS也存在不可避免的缺點。其一，它的臺式系統笨重且成本高昂，因此它們大多為各種生物研究或臨床實驗室所共有，可用性與易用性較低；其二，傳統FCM通常為開放式系統，因此科學家處理傳染性樣本需極其謹慎，以防基于水滴的分析與分選機制會產生有害氣溶膠[42]；其三，確保樣品分選質量的程序費時費力，如無RNase處理需要對FCM的整個管路和過濾器系統進行滅菌及清潔[36]；其四，FACS需要大量的樣品和試劑進行分析，進一步增加了總成本，使許多應用變得困難或不可能[35]。綜上所述，盡管FACS有強大的功能，但仍有諸多因素限制其在各種研究和應用中的利用。因此，克服問題并改進儀器將成為FACS進一步發展的要點。

2.3 基于激光誘導向前轉移技術的細胞分選技術

分選單細胞需運用激光誘導向前轉移(laserinduced forward transfer, LIFT)技術，該技術基于激光與物質的相互作用原理，可非接觸地從復雜生物樣本中將目標單細胞彈射至接收器中，實現準確、無損的單細胞分離(圖1)，且分選后的細胞可直接進行全基因組擴增或純培養等后續實驗[35,43]。基于LIFT技術的細胞篩分方法相比于傳統的細胞分離方法具有分選精準、流程簡易、適用廣泛等優勢。此外，LIFT細胞分選技術與FACS的區別在于前者具有高分辨率的顯微成像系統，可利用目標微生物的細胞形態、尺寸等自身特征無標記地識別生物體與非生物顆粒，再進行目標單細胞的自動或手動分選。總而言之，LIFT細胞分選技術突破了傳統的微生物研究領域，開創了微生物單細胞基因組學研究的新方法，或將拓展人類對未培養微生物的認知。

2013年，Wang等[44]運用LIFT技術精準快速地從復雜的口腔細菌樣本中分離出5種不同類型的細菌，驗證了該方法的可行性。2017年，Song等[43]利用LIFT技術從復雜的海水樣品中分離產類胡蘿卜素的光合細菌，從而通過單細胞全基因組測序進一步研究類胡蘿卜素合成途徑；同年他們還使用相同的方法從泰晤士河中分離出抗性微生物并測序分析，建立了表型與基因型的對應關系[45]。

LIFT細胞分選技術雖然可實現從復雜的樣品中分離出目標微生物，但如何準確定位目標微生物仍有待解決，于是有科學家提出了拉曼活化細胞分選(raman activated cell sorting，RACS)這一種無需標記的細胞分選方法[31]。2012年St?ckel等[46]利用芽孢的特殊拉曼光譜從7種粉末與芽孢桿菌的混合樣品中準確找到芽孢桿菌；2017年，Song等[43]利用類胡蘿卜素的特殊拉曼光譜從復雜的海水樣品中篩選光合細菌。2018年，Jing等[47]以13C底物培養海水樣品中的微生物，成功利用RACS方法從中分離出了原位固碳單細胞群，并測定其DNA序列，以重構其基因組。

綜上所述，拉曼光譜結合單細胞分選技術可繞過純菌株培養階段，直接實現活體單細胞的分離，快速便捷且省時省力。但此種方法也存在相應問題：首先，自發的拉曼散射較弱，約107個入射光子中僅有1個進行拉曼散射[48]，因此實驗需要較長的時間(通常為幾秒鐘)來獲取細胞的拉曼光譜，從而限制了RACS高通量的實現；其次，經LIFT分選技術彈射出的細胞活性會受一定程度影響，自身抗逆性差的微生物可能無法在分選后存活，從而使得后續培養實驗無法進行。因此，拉曼光譜結合單細胞分選技術想要發展成熟仍有很長的路要走。

2.4 基于原位培養的細胞分離技術

經過科學家幾十年來不斷對可培養微生物的重復培養、篩選后，想從中分離出結構獨特、活性顯著的新物種越來越困難。通過長期研究，人們已經認識到目前尚可培養的微生物僅占微生物總數的小部分[49]，而迄今為止無法在實驗室純培養的微生物包含著豐富的物種多樣性與巨大的可利用潛能。為了解決這一問題，科學家突破了傳統的培養方式，提出了原位培養技術。該技術的原理是通過合理模擬某種微生物生長繁殖的自然條件，以自然環境作為培養基，即可在不了解其生長所需全部元素組成的情況下對其進行培養。該方法作為對傳統菌種篩選方法的改良，也遵循先培養后篩選的主要思路。

2002年，Kaeberlein等[50]設計了擴散室(diffusion chamber)用于原位培養海洋潮汐帶沉積物中的微生物，擴散室中的微生物細胞可通過濾膜與潮汐帶沉積物進行物質信息交流(圖2)，研究發現該方法的微生物獲取率比傳統培養方法高300倍，且培養出了無法在傳統培養基中生存的MSC2。2008年，Gavrish等[51]以放線菌菌絲可以穿透0.22 μm孔徑的半透膜為基礎，發明了用于捕獲及原位培養絲狀放線菌的“陷阱”——trap裝置，實驗證明該方法分離到的放線菌數量與多樣性較傳統方法都有很大提高，且能獲得一些稀有放線菌。2015年，姜明國等[52]利用原位培養方法從紅樹林根際土壤中分離出了包含疑似新屬放線菌在內的多種微生物，研究表明該方法分離出的微生物較傳統方法擁有更高的多樣性與活性。2017年，Berdy等[53]研究出了高通量的微型擴散室——隔離芯片(isolation chip，IChip)，該裝置也可使微生物回收率提高至300倍且已成為分離新型抗菌微生物的主要培養工具。

原位培養的關鍵優勢在于科學家無需猜測新物種的生長需求，直接在滿足其生長繁殖需求的自然條件中進行培養，使用自然環境中的生長因子作為生長介質[50,53]。與此同時，原位培養也存在一個問題，即依舊無法于復雜的自然環境中了解微生物生存所必需的物質。Kaeberlein等[50]提出一種信號假說，即微生物可能需要鄰近微生物發出的特定信號，表明此為熟悉環境后再生長繁殖，其隱含意義為即使提供適當的營養條件，微生物也無法在陌生的環境中生長。這可在一定程度上解釋人工配制的傳統培養基為何無法培養出大多微生物。這個假說為今后的研究提供了一種可能的方向，而真實的原因還有待科學家不斷探究與突破，從而進一步推動基于原位培養的微生物分離技術的發展。

3 新技術發展展望

任何單一技術都不是完美的。從復雜環境中篩選目標微生物，雖然傳統菌種篩選方法費時費力，但現代主流基于單細胞分選的技術也存在難以完成精準篩選，即靶標性差等問題。因此，研究實踐中不能偏重或偏廢某個單一技術，更應該結合多個技術，取長補短。只有耦合多個技術的優勢，才能真正地推進微生物菌種的篩選。在此，提出如下幾個初步想法：

1)傳統方法與現代方法有機結合。使用傳統方法初篩富集后再利用現代方法精準篩選，將二者相結合做到既快速又準確。傳統方法在篩選菌種的過程中仍起到非常重要的作用，通過傳統方法可于復雜環境中富集目標微生物或者弱化非目標微生物，為現代方法的實施提供了便利性和成功率。反之，現代方法可以由人工智能提供自動化的手段，大大降低了因人工操作導致的低效率和可能的錯誤率。兩者結合將極大促進菌種篩選的過程。

2)加強源頭創新。選擇有代表性的供試土壤有助于提高篩選目標微生物成功率，利用大自然已經長期馴化富集群落的場地將會使得篩選過程事半功倍。

3)關注種間互作。物種間相生相克的機制也是篩選土壤微生物的困難之一，特別是營養缺陷型物種。應多關注微生物的種間互作，例如從海洋潮汐帶沉積物中分離出的純菌株MSC1和MSC2只能通過共培養于培養皿中生長[50]。

4)應用快速檢測。隨著今后菌種篩選通量的增大，需考慮結合快速檢測方法(例如酶活顯色反應[54]、核酸測定[55]等)，以便精準快速地從復雜環境中鎖定目標菌種，特別是具有高活性和特定功能的菌種，進而為下游分析提供良好的材料。

5)統籌下游分析。在篩得大量菌種后，還需思考如何更好地耦合下游分析，例如如何將細胞分選技術與單細胞測序、宏基因分析和宏轉錄組分析等結合起來。

6)利用分選技術人工構建微生物群落，以更好地揭示微生物群落對生態系統的影響。

總之，只有多角度、多方位、多技術地整合才能精準、高通量、快速地從大自然中獲得菌種。只有充分獲得微生物資源，才能夠更好地推動土壤微生物學，以及相關學科的進一步發展，才能真正地利用大自然賦予的瑰寶——微生物，反哺于人類、社會和環境的可持續性發展。