基于抗炎及抗氧化研究人參皂苷對衰老模型大鼠七氟烷麻醉后認知功能障礙的改善作用

樊榮

(西安市第一醫院麻醉科，陜西 西安 710002)

七氟烷是臨床廣泛使用的吸入型麻醉藥物，麻醉和鎮靜效果確切且對呼吸和循環系統影響較小，但有研究[1-2]發現，其會對老年患者的認知功能產生負面影響。另有研究[3]顯示，七氟烷會對衰老大鼠的認知功能及海馬超微結構造成損害。人參皂苷是人參中主要的活性成分，人參皂苷Re為人參皂苷中重要的一種單體成分，能夠在多種組織中發揮抗炎和抗氧化作用。研究[4]表明，人參皂苷Re能夠減輕慢性酒精中毒引起認知功能損傷?；诖耍緦嶒瀸⑷藚⒃碥誖e用于衰老模型大鼠七氟烷麻醉后的干預，具體分析了人參皂苷Re對認知功能障礙及炎癥反應、氧化應激反應的改善作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 成年雄性SD大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，D-半乳糖購自北京索萊寶公司，七氟烷購自山東魯南貝特制藥公司，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、丙二醛(MDA)的檢測試劑盒購自北京全式金公司，RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒購自武漢艾來德公司，p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的抗體購自CST公司。

1.2方法 實驗動物隨機分為對照組、衰老組、衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組，每組各8只。衰老組、衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組進行衰老模型制備，皮下注射0.125 g/kg 10%D-半乳糖溶液、1次/d、連續40 d；對照組皮下注射等劑量生理鹽水。衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組在衰老模型造模完成后放入麻醉箱內，通入3.2%七氟烷、持續6 h；對照組和衰老組放入麻醉箱內，通入空氣。經上述處理后，衰老+七氟烷+人參皂苷組給予50 mg/kg人參皂苷Re灌胃、1次/d、連續4周。于直徑1.6 m、高0.5 m的水迷宮內進行檢測，水深0.22 m，水溫22～26℃。第1～4天進行定位航行實驗，在第3象限正中放置直徑12 cm、高度20 cm的平臺，每天訓練4次，分別從4個象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠找到平臺的時間，若90 s內未找到平臺，則逃避潛伏期為90 s；第5天進行空間探索實驗，將大鼠從第1象限面向池壁放入水中，記錄大鼠90 s內穿越原平臺所在位置的次數。完成Morris水迷宮檢測后處死大鼠，收集外周血3～5 mL后離心分離血清；收集海馬組織，加入RIPA裂解液后勻漿，離心分離上清，采用試劑盒分別檢測血清及上清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GPX、MDA的含量。取海馬組織勻漿后的上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白含量，根據測定結果取含有30 μg蛋白的上清樣本進行Western blot實驗。將樣本加入聚丙烯酰胺凝膠后進行電泳，而后電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h后1∶1 000稀釋的p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體4℃孵育過夜；TBS-T溶液洗膜3遍、每遍5 min，室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，再次TBS-T溶液洗膜3遍、每遍10 min，最后在凝膠成像系統中顯影，得到p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、β-actin條帶，根據條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件錄入數據，四組間計量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1學習記憶功能的比較 與對照組比較，衰老組大鼠的逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠的逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠學習記憶功能的比較

2.2血清及海馬中炎癥因子含量的比較 與對照組比較，衰老組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清及海馬中炎癥因子含量的比較

2.3血清及海馬中氧化應激指標的比較 與對照組比較，衰老組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量減少，MDA的含量增加(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量增加，MDA的含量減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量減少，MDA的含量增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及海馬中應激指標的比較

2.4p38MAPK、ERK1/2、JNK表達的比較 與對照組比較，衰老組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達水平增加，p-ERK1/2的表達水平減少(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達水平增加，p-ERK1/2的表達水平減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠海馬中p-p38MAPK的表達水平無明顯變化(P>0.05)，p-JNK的表達水平減少、p-ERK1/2的表達水平增加(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 各組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白條帶

表4 各組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK表達量的比較

3 討 論

人參皂苷Re是人參皂苷中重要的一種單體成分，具有廣泛的生物學作用。有學者[5-6]分別將人參皂苷Re用于精神分裂癥大鼠及阿爾茨海默小鼠的干預，結果顯示動物的行為學表現及認知功能均明顯改善。本研究結果顯示，與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組的逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數增加，表明人參皂苷Re對衰老大鼠七氟烷麻醉后的認識功能具有改善作用。

海馬是大腦中與認知、學習、記憶等功能直接相關的腦區，海馬結構的損害能夠引起認知功能障礙、學習記憶能力減退。研究[7-8]表明，在七氟烷誘導認知功能障礙的過程中，海馬中的炎癥反應和氧化應激反應的激活與結構損害直接相關。本研究表明，衰老組及衰老+七氟烷組血清、海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量增加，SOD、GPX的含量減少且衰老+七氟烷組的上述變化較衰老組更為顯著，表明衰老及七氟烷麻醉均對海馬中的炎癥和氧化應激反應具有激活作用。人參皂苷Re具有抗炎和抗氧化作用，能夠在神經元細胞、內皮細胞、心肌細胞中減輕多種病理因素引起的炎癥反應和氧化應激反應[9-10]。本研究結果顯示，血清、海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量減少，SOD、GPX的含量增加，表明人參皂苷Re能夠在衰老大鼠七氟烷麻醉后發揮抗炎和抗氧化作用，這可能是其改善認知功能的機制之一。

MAPK通路是細胞內感受能量變化并調控凋亡、炎癥、氧化應激的重要通路，ERK1/2、JNK、p38MAPK均屬于MAPK家族。報道[11-12]顯示，七氟烷能夠使海馬中的JNK、p38MAPK發生激活，ERK1/2受到抑制。本研究結果顯示，衰老+七氟烷組海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達水平增加，p-ERK1/2的表達水平減少，表明上述信號通路的變化可能參與了七氟烷誘導的海馬組織炎癥及氧化應激激活，進而引起認知功能減退。在人參皂苷Re干預后，海馬中p-p38MAPK的表達水平無明顯變化、p-JNK的表達水平減少、p-ERK1/2的表達水平增加，表明人參皂苷Re可能通過ERK1/2和JNK通路發揮改善認知功能及抑制炎癥反應、氧化應激反應的作用。