山慈菇酯提物對(duì)4T1乳腺癌免疫微環(huán)境的影響

張 楠， 曹曉東， 劉 穎， 張子英*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 呼和浩特 010110； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)GLP中心， 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 呼和浩特 010110)

乳腺癌是全球第2大高發(fā)癌，是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在全球排第5[1]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)(即雌激素受體、孕激素受體和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2)在診斷初期就合并遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，患者的存活率僅為23%[2]。TNBC化療雖有一定的療效，但并未延長(zhǎng)患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期[3]。目前TNBC患者的預(yù)后差，且沒(méi)有合適的內(nèi)分泌治療和靶向治療手段[4]。機(jī)體可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能產(chǎn)生抗腫瘤作用，而腫瘤細(xì)胞也可以產(chǎn)生免疫逃逸，通過(guò)形成特殊的免疫抑制微環(huán)境逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，產(chǎn)生免疫逃逸[5]。文獻(xiàn)[6]報(bào)道免疫調(diào)節(jié)治療TNBC具有相對(duì)較好的預(yù)后。因此，免疫治療應(yīng)用于TNBC已成為國(guó)際乳腺癌研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[7]。

腫瘤免疫微環(huán)境主要由免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞因子構(gòu)成。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，主要包括表達(dá)CD4+的輔助性T細(xì)胞(helper T cell, Th)及表達(dá)CD8+的細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T Cell，CTL)；Th按功能主要分為T(mén)h1和Th2，其中Th1主要分泌IL-2(interleukin-2)、TNF-α(tumor necrosis factor-α)、IFN-γ(interferon-γ)等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而Th2則主要分泌IL-10(interleukin-10)等介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在正常機(jī)體中，Th1促進(jìn)組織破壞，為CTL細(xì)胞的腫瘤排斥提供幫助；而Th2促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抑制細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。Th1和Th2一旦失衡，Th1向Th2型發(fā)生漂移，就會(huì)導(dǎo)致免疫功能紊亂發(fā)生腫瘤[8-9]。研究表明，在乳腺癌患者的體內(nèi)，Th1通常處于低表達(dá)，而Th2型處于高表達(dá)狀態(tài)[8]。因此，需要研究上述免疫細(xì)胞及免疫因子在TNBC中的作用，為開(kāi)發(fā)抗TNBC的免疫調(diào)節(jié)藥物提供藥理學(xué)依據(jù)。

山慈菇主要以蘭科植物杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)、獨(dú)蒜蘭(Pleionebulbocodioides)以及云南獨(dú)蒜蘭(PleioneyunnanensisRolfe)的干燥假鱗莖作為基源植物[10]。它們的乙酸乙酯提取物共同的成分主要為：菲及二氫菲類(lèi)和聯(lián)芐類(lèi)化合物[11-12]具有抗腫瘤、抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性及細(xì)胞毒活性等多種生物活性[13]。研究發(fā)現(xiàn)山慈菇提取物具有調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的作用[14]。檢索TcmSP database發(fā)現(xiàn)山慈菇酯提物(cremastra appendiculata，CrAp)成分β-谷甾醇(β-sitosterol)、4-甲氧基菲-2,7-二醇(flavanthrinin)均有抗乳腺癌的作用，原兒茶酸(protocatechuic acid)[15]參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。現(xiàn)研究CrAp對(duì)4T1乳腺癌的作用，4T1源于小鼠TNBC，而人類(lèi)與小鼠調(diào)控乳腺癌的部分基因核苷酸序列具有高度同源性[16]。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試劑及材料

4T1乳腺癌細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(批號(hào)：S118024，Gibco公司)；0.25% Trypsin-EDTA(批號(hào)：2046777，Gibco公司)；FBS(胎牛血清，批號(hào)：11G313，ExCell Bio公司)；Penicillin-Streptomycin雙抗(批號(hào)：51H351，ExCell Bio公司)；DMSO(二甲基亞砜，批號(hào)：1213C0314；北京索萊寶科技有限公司)；PBS(磷酸緩沖鹽溶液，批號(hào)：AC10260538，Hyclone公司)；鹽酸阿霉素(批號(hào)：3181024，北京索萊寶科技有限公司)；山慈菇(批號(hào)：17122501，內(nèi)蒙古暮昕藥業(yè))；ELISA試劑盒：白介素-2(IL-2)(批號(hào)：B265707)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號(hào)：B288663)，白介素-10(IL-10)(批號(hào)：B299453)，干擾素-γ(IFN-γ)(批號(hào)：B298549)，以上均購(gòu)自Biolengend公司；ELISA終止液(批號(hào)：20170830，北京索萊寶科技有限公司)；生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司)；二甲苯(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)；甲醛(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；無(wú)水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

Leica DM200熒光顯微鏡(Leica公司)；Leica RM2235切片機(jī)(Leica公司)；Leica EG115021組織包埋機(jī)(Leica公司)；Leica Auto Stainer XL染色機(jī)(Leica公司)；Leica ASP200s組織脫水儀(Leica公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Nuair公司)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；恒溫水箱(江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))；倒置顯微鏡(Olympus公司)；渦旋儀(海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(銀龍島五金工具有限公司)；4 ℃冰箱(海爾)；-20 ℃冰箱(中科美菱)；EnSpire Multimode Plate Reader酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(18±2) g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)鼠房，飼養(yǎng)溫度 18～22 ℃，相對(duì)濕度60.0%±10.0%。

1.4 藥品及試劑的制備

1.4.1 山慈菇酯提物(CrAp)制備

將4 kg山慈菇以4倍量的無(wú)水乙醇回流提取3次，濃縮液1 000 mL。加水，加熱揮去乙醇，形成不溶于水的膠體，過(guò)濾分離沉淀，用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取3次，取乙酸乙酯萃取部分，冷藏，抽濾，得提取物，將提取物低溫烘干，待用[17]。

1.4.2 CrAp 溶液

取125 mg CrAp，加0.1 mL DMSO溶解，加培養(yǎng)基至10 mL，配制成12.5 mg/mL 的母液，過(guò)濾，分裝，4 ℃保存?zhèn)溆茫糜诩?xì)胞。取960 mg CrAp，加入0.5 mL無(wú)水乙醇同時(shí)加入0.05 mL 吐溫-80助溶，加入適量生理鹽水，超聲30 min，溶解完全后加入生理鹽水定容至10 mL，配制成96 mg/mL 的母液，過(guò)濾，用前稀釋?zhuān)? ℃保存?zhèn)溆?小鼠所用的劑量均為96 mg/kg)，用于小鼠。

1.4.3 阿霉素(ADM)溶液

取100 μg ADM標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL 培養(yǎng)基溶解，配制成100 μg/mL 的母液，過(guò)濾，分裝，4 ℃保存?zhèn)溆茫糜诩?xì)胞。取2 mg ADM標(biāo)準(zhǔn)品，加入10 mL 生理鹽水溶解，配制成0.2 mg/mL 的母液，4 ℃保存?zhèn)溆?小鼠所用劑量均為2 mg/kg)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

細(xì)胞覆蓋率達(dá)到培養(yǎng)瓶的80%左右，細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度1×104個(gè)/mL，接種于24孔板中，每孔1 mL，24 h后開(kāi)始計(jì)數(shù)，以后每隔24 h計(jì)數(shù)一次，每次取4孔細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果取4孔平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)6 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度的CrAp在不同時(shí)間對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

4T1乳腺癌細(xì)胞用0.25%胰酶消化，加入培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)4T1細(xì)胞接種于96孔板上，每孔100 μL， ADM陽(yáng)性藥組(10 μg/mL)、空白對(duì)照組(加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基)，同時(shí)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，細(xì)胞貼壁后，吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度(12 500、1 250、125、12.5、1.25、0.125 μg/mL)的CrAp，陽(yáng)性藥組加入ADM，空白對(duì)照組加入100 μL不含藥物的培養(yǎng)基。同時(shí)使用3塊96孔板進(jìn)行上述步驟，放入37 ℃，5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，避光，孵育4 h，小心地吸出每個(gè)孔內(nèi)所有液體，加入150 μL DMSO，繼續(xù)避光，將96孔板放到振蕩搖床上低速震蕩10 min，上機(jī)檢測(cè)，在OD490測(cè)量各孔的吸光值，抑制率=(對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/對(duì)照組OD值×100%，進(jìn)行計(jì)算。

2.3 動(dòng)物分組和造模

2.3.1 具體步驟

BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進(jìn)行植瘤。BALB/c小鼠接種腫瘤前用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉后，將小鼠采取仰臥置于操作臺(tái)上，用酒精棉球擦拭，右腋乳腺處皮膚皮下注射1×106個(gè)4T1細(xì)胞。5～7 d后，待小鼠腫瘤長(zhǎng)到2～5 mm后，觸摸有不規(guī)則的硬塊，即代表植瘤成功。

2.3.2 動(dòng)物分組

植瘤成功的BALB/c小鼠，隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、模型組、ADM陽(yáng)性對(duì)照組、CrAp組以及CrAp+ADM組，每組各15只。空白對(duì)照組及模型組腹腔注射生理鹽水，每日一次，CrAp組以96 mg/kg腹腔注射給藥，每日一次，陽(yáng)性對(duì)照組以2 mg/kg ADM腹腔注射給藥，隔日一次，CrAp+ADM組腹腔注射給予相同劑量的CrAp和ADM，連續(xù)給藥21 d。

2.4 CrAp體內(nèi)抗4T1荷瘤小鼠數(shù)據(jù)的處理

2.4.1 小鼠一般行為觀察

觀察小鼠活動(dòng)、毛發(fā)及飲食等基本變化。

2.4.2 繪制小鼠體重生長(zhǎng)曲線(xiàn)

小鼠體重生長(zhǎng)曲線(xiàn)：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，植瘤成功后測(cè)量小鼠體重，隨機(jī)分組后進(jìn)行給藥，每隔7 d測(cè)量一次體重，共4次，繪制體重生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.4.3 小鼠在體抑瘤指標(biāo)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)：造模成功后的小鼠，每隔3 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，其表達(dá)式為V=ab2/2，共7次，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.4.4 小鼠離體抑瘤指標(biāo)，計(jì)算藥物抑瘤率

小鼠稱(chēng)重，剝離小鼠腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

2.4.5 HE染色觀察小鼠癌組織病理學(xué)變化

取癌組織于4%多聚甲醛浸泡24 h 固定后，將組織梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色、中性樹(shù)膠封片。最后光學(xué)顯微鏡觀察癌組織結(jié)構(gòu)的改變并拍照。

2.4.6 ELISA法檢測(cè)癌組織中相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)

取小鼠癌組織，加入預(yù)冷的PBS，制成10%組織勻漿，離心3 000 r/min，20 min，取上清液，保存于-20 ℃，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)組織中 IL-2、TNF-α、IFN-γ及IL-10的蛋白表達(dá)水平。在96孔板上加100 μL 稀釋過(guò)后的一抗，放置在2～8 ℃中過(guò)夜。所有實(shí)驗(yàn)試劑于室溫中放置30 min，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品孔，并且所有樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取出包被后的96孔板，棄掉一抗，洗板4次，每次用300 μL的清洗液，浸泡30 s，吸干，擦干，以下洗板步驟同上。為了減少特異性結(jié)合，每孔加入1×樣品稀釋液，室溫孵育1 h。洗板4次，每孔加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，適當(dāng)搖晃，充分混勻，密封，室溫孵育2 h。洗板4次，每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，密封，室溫孵育1 h。洗板4次，每孔加入100 μL稀釋后的親和素-HRP，密封，室溫孵育30 min。洗板5次，最后一次清洗時(shí)，清洗緩沖液浸泡1 min，可有助于減少背景。加100 μL 配制好的顯色劑，避光孵育30 min，板內(nèi)顏色變?yōu)樗{(lán)色。每孔加入100 μL終止液，板內(nèi)溶液由藍(lán)變?yōu)辄S色。5 min內(nèi)在酶標(biāo)儀的450 nm讀數(shù)測(cè)定OD值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品OD值，計(jì)算樣品含量。

2.5 TMT蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)CrAp對(duì)4T1癌組織免疫相關(guān)差異蛋白的影響

提取蛋白后，利用蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白溶液中使用二硫蘇糖醇、碘代乙酰胺處理后，胰酶酶解，酶解的肽段根據(jù)TMT試劑盒操作說(shuō)明標(biāo)記肽段。肽段用高pH反向高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分級(jí)，色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm粒徑，4.6 mm 內(nèi)徑，250 mm長(zhǎng))。肽段分級(jí)梯度為8%～32%乙腈、pH 9，60 min分離60個(gè)組分，隨后肽段合并為18個(gè)組分，合并后的組分經(jīng)真空冷凍干燥。肽段用液相色譜流動(dòng)相A相[0.1% (v/v) 甲酸水溶液]溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速維持在500 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入離子源中進(jìn)行電離后，經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜分析。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫(kù)為Mus_musculus_10090_SP_20191115(17 032條序列)，添加了反庫(kù)以消除計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫(kù)中加入了常見(jiàn)的污染庫(kù)，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響；酶切方式設(shè)置為T(mén)rypsin/P。質(zhì)譜鑒定到的肽段長(zhǎng)度的分布符合質(zhì)控要求后，分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，使用MoMo分析Motif；使用Inter ProScan注釋GO、Domain；使用Wolfpsort，CELLO亞細(xì)胞定位；使用Perl module富集分析。

3 數(shù)據(jù)處理

4 結(jié)果

4.1 不同濃度的CrAp在不同時(shí)間對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示：0～1 d時(shí)，細(xì)胞經(jīng)過(guò)短暫的懸浮開(kāi)始貼壁，細(xì)胞出現(xiàn)增殖；1～3 d時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞開(kāi)始迅速增殖；在3～4 d時(shí)，細(xì)胞繼續(xù)增殖，但增殖趨勢(shì)已經(jīng)緩慢；4 d時(shí)，細(xì)胞到達(dá)平頂期，細(xì)胞不再增殖；4～6 d時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡，如圖1(a)所示。MTT結(jié)果顯示，24、48、72 h時(shí)，不同濃度的CrAp均有不同程度的抑制率；CrAp抑制率范圍為13.48%～74.47%，其中CrAp(125 μg/mL)在72 h抑制作用最強(qiáng)，抑制率為74.47%；與ADM組相比，24、48、72 h時(shí)，CrAp(125 μg/mL)抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余CrAp抑制率明顯下降(P<0.01)；隨著時(shí)間增加，CrAp(125、12.5 μg/mL)組抑制作用明顯，抑制率無(wú)劑量依賴(lài)性，如圖1(b)所示。

**表示與阿霉素組相比P<0.01

4.2 小鼠一般行為觀察

空白組小鼠，毛發(fā)發(fā)亮，偶見(jiàn)撕咬斗爭(zhēng)，采取單獨(dú)飼養(yǎng)，避免撕咬，進(jìn)食規(guī)律，精神正常，喜愛(ài)活動(dòng)；模型組小鼠，隨著天數(shù)增加，活動(dòng)減少，精神狀態(tài)欠佳，進(jìn)食進(jìn)水量明顯減少，不喜梳理毛發(fā)，毛發(fā)欠光澤，并存在掉毛現(xiàn)象；ADM組小鼠，活動(dòng)欠佳，進(jìn)食進(jìn)水量下降，隨著天數(shù)增加，毛發(fā)稀疏干枯，體形消瘦；CrAp組小鼠，活動(dòng)以及進(jìn)食進(jìn)水量正常，隨著天數(shù)增加，偶見(jiàn)掉毛，但毛發(fā)顏色無(wú)明顯變化；CrAp+ADM組小鼠，進(jìn)食進(jìn)水略有減少，較ADM組有所改善，毛發(fā)暗淡，偶見(jiàn)梳理毛發(fā)。

4.3 小鼠體重變化曲線(xiàn)

小鼠體重結(jié)果顯示，在給藥21 d時(shí)，與空白組相比，模型組體重明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，ADM組和CrAp+ADM組小鼠體重均明顯降低(P<0.01)，但CrAp組小鼠體重明顯增加(P<0.01)；同時(shí)與ADM組相比，CrAp組和CrAp+ADM組小鼠體重均明顯增加(P<0.01)，如圖2所示。

**表示與空白組相比P<0.01；##表示與模型組相比P<0.01；＊＊表示與阿霉素組相比P<0.01

4.4 小鼠腫瘤增長(zhǎng)曲線(xiàn)

小鼠腫瘤增長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，在給藥21 d時(shí)，與模型組相比，各藥物組腫瘤體積均明顯減小(P<0.01)；與ADM組相比，CrAp+ADM組腫瘤體積減小，但CrAp+ADM和CrAp組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖3所示。

##表示與模型組相比P<0.01

4.5 小鼠抑瘤率

小鼠抑瘤率結(jié)果顯示，各藥物組對(duì)荷瘤小鼠腫瘤均有不同程度的抑制作用，CrAp+ADM組抑瘤作用最強(qiáng)，為53.67%。腫瘤重量結(jié)果顯示，與模型組相比，各藥物組腫瘤重量均明顯降低(P<0.01)；與ADM組相比，CrAp組和CrAp+ADM組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖4所示。

4.6 癌組織病理學(xué)結(jié)果

模型組腫瘤細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞核大，細(xì)胞形態(tài)完好，腫瘤細(xì)胞數(shù)目較多，壞死區(qū)域少見(jiàn)；與模型組比較，ADM組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，邊緣處有少量未壞死的腫瘤細(xì)胞，大部分腫瘤細(xì)胞破裂、胞核溶解，壞死區(qū)域較大，CrAp組腫瘤細(xì)胞數(shù)目略有減少，腫瘤細(xì)胞密度降低以及存在部分壞死區(qū)域，但不及ADM組，CrAp+ADM組腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少，腫瘤細(xì)胞形態(tài)不完全且胞核溶解比例較大，并伴隨著較大程度的壞死區(qū)域，且各給藥組出現(xiàn)明顯的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)。

圖4 小鼠腫瘤大小(體外)和抑瘤率

各組別倍數(shù)均為(×200)；黑色箭頭所指區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞壞死區(qū)域

4.7 小鼠癌組織中IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-10水平的變化

癌組織結(jié)果顯示，與模型組相比，各藥物組IL-2含量均明顯升高(P<0.01)，而TNF-α的含量均明顯降低(P<0.01)，CrAp組和CrAp+ADM組IFN-γ含量明顯升高(P<0.01)，而IL-10含量明顯下降(P<0.01)，ADM組IL-10含量下降(P<0.05)；同時(shí)與ADM組相比，CrAp組IL-2和TNF-α含量明顯降低(P<0.01)，CrAp+ADM組TNF-α含量明顯升高(P<0.01)，以及CrAp組和CrAp+ADM組IFN-γ含量明顯升高(P<0.01)，其余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如圖6所示。

#表示與模型組相比P<0.05；##表示與模型組相比P<0.01；ΔΔ表示與阿霉素組相比P<0.01

4.8 小鼠癌組織中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的變化

CrAp/CON利用MaxQuant軟件在IPI(ipternational protein index)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，質(zhì)譜鑒定有15個(gè)上調(diào)蛋白，胸腺素β-4一個(gè)下調(diào)蛋白，其中以1.5倍為差異篩選出與乳腺癌免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)(表1)。Gene Ontology(GO)分析：差異蛋白Ighm、H2bc4、S100a8、S100a9參與免疫系統(tǒng)過(guò)程，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)外分布較廣；Hist1h3b、S100a8、S100a9參與細(xì)胞黏附，Protein S100與免疫調(diào)節(jié)和凋亡密切相關(guān)。上調(diào)Histone、Protein S100參與Toll 4受體結(jié)合，參與蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝、白細(xì)胞聚集、白細(xì)胞與細(xì)胞的黏附、大分子甲基化、染色質(zhì)組織、肽分泌的調(diào)節(jié)、細(xì)胞大分子復(fù)合物組裝等生物進(jìn)程。

表1 CrAp/CON在4T1乳腺癌中與免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的差異表達(dá)蛋白

5 討論

ADM作為臨床治療乳腺癌最有效的藥物之一，抗菌譜廣，應(yīng)用廣泛，參照文獻(xiàn)相關(guān)給藥用量[17-18]，結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)研究，將2 mg/kg的ADM作為實(shí)驗(yàn)所用劑量。本課題組也曾將4T1細(xì)胞接種于具有完全免疫功能的昆明小鼠，但未成功造模，因此認(rèn)為免疫功能與4T1乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

山慈菇作為傳統(tǒng)的中蒙醫(yī)抗癌藥，目前對(duì)于山慈菇抗乳腺癌的研究逐漸增多。劉銀花等[19]發(fā)現(xiàn)不同濃度的山慈菇水提液對(duì)鼠源的TNBC細(xì)胞4T1增殖均有明顯抑制作用。研究表明，山慈菇明顯抑制人源TNBC細(xì)胞MDA-MB-231以及ER+人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞T-47D的增殖[20-21]。同時(shí)不同濃度山慈菇水煎劑均可明顯抑制乳腺癌T-47D、MDA-MB-231細(xì)胞的遷移[20-21]。楊雪威等[22]進(jìn)一步證明山慈菇明顯降低乳腺癌大鼠血清以及乳腺癌大鼠腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的水平，干擾乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移[23]。但是目前對(duì)于乳腺癌方面的研究大多以山慈菇水煎劑為主，并且主要停留在體外實(shí)驗(yàn)階段。分析文獻(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)研究山慈菇酯提取物抗TNBC的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，因而，有必要運(yùn)用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法對(duì)CrAp進(jìn)行深入研究，探索其抗4T1乳腺癌的分子機(jī)制。

5.1 CrAp體內(nèi)抗4T1乳腺癌作用

5.1.1 CrAp對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的影響

采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)CrAp對(duì)4T1 細(xì)胞的增殖毒性的影響，需要在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期給藥才能更準(zhǔn)確地反映CrAp的細(xì)胞毒作用。生長(zhǎng)曲線(xiàn)是測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目以及細(xì)胞活力的主要方法，可以有效觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)為MTT法加入的細(xì)胞濃度提供更好的依據(jù)，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N濃度可避免濃度太低出現(xiàn)遲緩期，濃度太高過(guò)早到達(dá)衰退期，研究發(fā)現(xiàn)，4T1乳腺癌細(xì)胞在24～72 h，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此在MTT實(shí)驗(yàn)中，選擇細(xì)胞接種24 h后開(kāi)始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。MTT法是檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)最常用的方法之一，利用MTT法研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的CrAp在不同時(shí)間對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制率范圍為13.48%～74.47%。在24、48、72 h時(shí)，不同濃度的CrAp均具有抑制4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，125 μg/mL CrAp的抑制作用最強(qiáng)。

5.1.2 CrAp對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠的影響

在建立4T1乳腺癌小鼠模型的研究中，小鼠一般行為、體重變化、腫瘤增長(zhǎng)、抑瘤率是探討荷瘤小鼠腫瘤狀態(tài)最常用的評(píng)價(jià)方法。研究發(fā)現(xiàn)， CrAp在抗乳腺癌的同時(shí)，一定程度上改善了荷瘤小鼠的生存狀態(tài)；CrAp可以改善小鼠的一般行為，進(jìn)而說(shuō)明化療藥在殺傷乳腺癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損害正常細(xì)胞，減弱了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別殺傷能力，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，而CrAp可以改善上述癥狀，因而考慮可以中西藥聯(lián)合應(yīng)用以提高癌癥患者機(jī)體的免疫力。在繪制腫瘤曲線(xiàn)時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)CrAp可以有效抑制腫瘤的增長(zhǎng)。并且CrAp+ADM組抑瘤率比單獨(dú)應(yīng)用ADM以及CrAp抑瘤率更高，說(shuō)明二者聯(lián)合可以協(xié)同抗乳腺癌作用，同時(shí)可以有效改善ADM引起的不良反應(yīng)。

5.1.3 CrAp對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠癌組織的影響

HE染色是最常用的染色法之一，蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色，伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色，通過(guò)HE染色可以有效觀察癌組織形態(tài)以及病理學(xué)的改變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CrAp不僅可以抑制4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖，還可以抑制4T1乳腺癌小鼠腫瘤的增長(zhǎng)，增加荷瘤小鼠的體重。

5.2 CrAp對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠癌組織中免疫因子蛋白水平的影響

IL-2可以刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)NK細(xì)胞，激活淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，還可以激活B細(xì)胞，協(xié)同其他細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ)發(fā)揮抗腫瘤作用[24-25]。結(jié)果表明，癌組織中，CrAp可以升高IL-2的表達(dá)，各藥物組均可降低TNF-α的含量。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體內(nèi)正常情況下TNF-α具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死及激活淋巴細(xì)胞因子等多種抗腫瘤和抗感染的作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌癌旁組織及正常組織中TNF-α表達(dá)水平均高于正常人群的乳腺組織，患有腫瘤的患者，腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被腫瘤激活而高分泌TNF-α，使整個(gè)腫瘤高表達(dá)TNF-α[27]。激活免疫細(xì)胞釋放過(guò)量的TNF-α可以引發(fā)癌組織的局部免疫應(yīng)激反應(yīng)，引起患者的免疫系統(tǒng)損傷，同時(shí)導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生紊亂[28-29]。而在乳腺癌微環(huán)境中，激活體內(nèi)的免疫細(xì)胞釋放TNF-α，引起癌組織局部TNF-α水平上升。考慮在癌組織中，CrAp通過(guò)降低腫瘤微環(huán)境中TNF-α的表達(dá)，參與調(diào)控乳腺癌免疫微環(huán)境。IFN-γ具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生[30]。研究發(fā)現(xiàn)模型組IFN-γ含量較低，這與相關(guān)文獻(xiàn)提及的4T1乳腺癌造模組的IL-2、IFN-γ的含量較正常組低結(jié)果一致[31]。在癌組織CrAp明顯升高IFN-γ含量，且在癌組織中CrAp協(xié)同ADM增加IFN-γ的表達(dá)。說(shuō)明CrAp可以通過(guò)增強(qiáng)IFN-γ的表達(dá)產(chǎn)生抗4T1乳腺癌的免疫調(diào)節(jié)作用。某些誘因使腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞發(fā)生Th2失衡后，可產(chǎn)生大量的IL-4，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織產(chǎn)生IL-10[32-33]。IL-10結(jié)果顯示，CrAp明顯降低癌組織中IL-10的含量。提示CrAp通過(guò)降低IL-10的含量增強(qiáng)了抗4T1荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。

有研究表明，在乳腺癌動(dòng)物模型以及人乳腺癌中，乳腺癌的Th2表達(dá)升高，Th1表達(dá)降低[34-35]。考慮升高Th1含量與降低Th2含量可以增強(qiáng)機(jī)體抗乳腺癌的免疫調(diào)節(jié)功能。而上述這些結(jié)果均表明，在癌組織中通過(guò)提高IL-2、IFN-γ而降低TNF-α、IL-10免疫因子的表達(dá)，發(fā)揮了腫瘤微環(huán)境中局部免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)CrAp+ADM組調(diào)控上述免疫因子作用比單獨(dú)應(yīng)用CrAp和ADM更顯著。

5.3 CrAp對(duì)4T1乳腺癌免疫微環(huán)境中與免疫相關(guān)的差異蛋白水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)CrAp可以降低胸腺素β-4(thymosin β4，Tβ-4)，而Tβ-4調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧經(jīng)歷的癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[36]；且Tβ-4通過(guò)下調(diào)層黏連蛋白-5的表達(dá)量調(diào)控細(xì)胞遷移[37]。Tβ-4可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Tβ4和Tβ10均能促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞的遷移，體內(nèi)促進(jìn)小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移，其促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用可能與上調(diào)MMP2，MMP9，Sdf1(stromal cell-derived factor 1) 和Stat3(signal transducer and activator of transcription 3)mRNA 水平有關(guān)[38]。肥大細(xì)胞表達(dá)膜蛋白1(mast cell-expressed membrane protein 1，MCEMP1)沉默導(dǎo)致VEGF的上調(diào)，caspase-3的下調(diào)，并增加缺血性卒中大鼠的微血管密度(microvessel density，MVD)，說(shuō)明MCEMP1降低VEGF含量，使caspase-3含量增加[39]。由此可見(jiàn)Tβ-4的下調(diào)和MCEMP1的上調(diào)可能是CrAp產(chǎn)生抗4T1乳腺癌的機(jī)制。S100-A8蛋白與ER表達(dá)水平和組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)，并與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[40]。S100A9表達(dá)水平在乳腺癌血清和組織中明顯升高，在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，提示CrAp可能促使細(xì)胞內(nèi)鈣含量增加。S100A8 和S100A9 均為S100 鈣結(jié)合蛋白(S100, a member of calcium binding proteins, S100/CaBP)家族成員，研究顯示S100A8 和S100A9 在多種腫瘤中高表達(dá)[41]，在多種腫瘤細(xì)胞中，S100A8/A9通過(guò)雙重機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41-42]，由此可見(jiàn)S100A8 和S100A9的上調(diào)可能是CrAp促進(jìn)4T1乳腺癌凋亡和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)的主要機(jī)制。

6 結(jié)論

(1)在體外，CrAp能有效抑制4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖；在體內(nèi)，CrAp可以抑制4T1荷瘤小鼠癌組織的增長(zhǎng)，并且增加荷瘤小鼠的體重。同時(shí)CrAp和ADM聯(lián)合用藥可以改善應(yīng)用ADM的小鼠生存狀態(tài)，提高小鼠體重以及抑瘤率。

(2)CrAp提高癌組織中IL-2、IFN-γ而降低TNF-α、IL-10免疫因子的表達(dá)，發(fā)揮了腫瘤微環(huán)境中局部免疫調(diào)節(jié)作用。CrAp作用于癌組織中的差異蛋白功能多與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程相關(guān)。