TBBPA-DHEE暴露對斑馬魚的神經毒性及機制研究

徐彤， 馮偉偉， 丁陽陽， 錢顯， 陳瑤， 茆廣華， 仰榴青， 吳向陽

(江蘇大學1. 環境與安全工程學院； 2. 化工學院， 江蘇 鎮江 212013)

四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前使用最為廣泛的一種溴代阻燃劑，各種環境介質如土壤、水體、大氣及生物體中均可檢測到。已有研究表明，TBBPA可通過干擾神經相關激素、神經遞質分泌和神經相關信號通路產生神經毒性[1]。TBBPA的部分結構與甲狀腺激素相似，進入生物體血液后可擾亂甲狀腺激素分泌，導致內分泌紊亂并進一步造成神經元損傷[2]。四溴雙酚A雙(2-羥基乙基)醚[TBBPA bis(2-hydroxyetyl) ether，TBBPA-DHEE]是TBBPA典型的衍生物之一，廣泛用于生產工程聚合物、涂料、熱塑性聚酯及聚苯乙烯泡沫等材料，已在水體、土壤等環境介質中檢出[3-4]。其結構與TBBPA母體高度類似，是否具有類似的毒理學效應尚不清楚。研究發現，TBBPA-DHEE對大鼠嗜鉻瘤細胞、新生大鼠均具有神經毒性[5-6]，而對水生動物的影響尚不清楚。因此，本文以斑馬魚胚胎為研究對象，通過對胚胎發育相關指標、行為學指標、酶學指標及Ca2+信號通路相關mRNA表達的分析，系統研究TBBPA-DHEE暴露對斑馬魚胚胎的神經毒性，并探明潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑:TBBPA-DHEE標準品(純度98%)購于美國Sigma-Aldrich公司，其余試劑購于國藥集團，均為分析純；RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)；逆轉錄試劑盒(美國Bio-Rad公司)；引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計。

主要儀器:體式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；超低溫冰箱(日本Panasonic公司)；組織勻漿器(德國IKA公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo公司)；實時熒光定量PCR(瑞士Roche公司)；斑馬魚行為分析系統(荷蘭Noldus公司)。

1.2 TBBPA-DHEE溶液的配置

TBBPA-DHEE用二甲基亞砜助溶，配制成27 mmol/L的貯備液避光保存，實驗前用胚胎培養液將貯備液稀釋。根據環境相關濃度，最終暴露濃度設置低、中、高劑量組分別為0.086 mg/L、0.860 mg/L和8.600 mg/L，各劑量組二甲基亞砜含量均為0.05%(V/V)，并設置空白對照組和二甲基亞砜組。

1.3 受試動物

親魚選用AB系斑馬魚(Daniorerio)，購于南京一樹梨花生物科技有限公司。用海鹽調節去離子水電導率至500～530 μS/cm飼養斑馬魚。魚房溫度(28.0±0.5)℃，光照周期14 h ∶10 h，每日喂食2次豐年蝦。實驗前一天，將雌雄親魚按1 ∶1比例放入魚卵收集缸中；次日早取出隔板，雌雄斑馬魚自行交配，30 min后收集產下的受精卵，挑選出發育正常的胚胎用于后續胚胎暴露實驗。

1.4 斑馬魚胚胎發育毒性

將已暴露的胚胎置于培養箱中，設置培養箱的培養條件與魚房一致，暴露至120 hpf(hourpost fenilized，受精后數小時)，每天更換一半暴露液。自暴露開始后每24 h在體式顯微鏡下觀察胚胎和(或)脫膜后幼魚的死亡、孵化情況，觀察至96 hpf。分別于24、48、72和96 hpf觀察胚胎/仔魚的畸形情況。48、72 hpf時置于顯微鏡下觀察胚胎/仔魚1 min內的心跳次數。96 hpf時在顯微鏡下測量仔魚從頭部最前端到尾尖的長度(不包括尾鰭)。

1.5 斑馬魚仔魚行為學實驗

1.5.1 自主運動分析 28～29 hpf時，在體式顯微鏡下觀測胚胎1 min內的自主運動次數。

1.5.2 仔魚運動行為分析 斑馬魚仔魚的運動行為量化用斑馬魚行為分析系統進行測定。將120 hpf的斑馬魚仔魚置于96孔板中，每孔一條魚測定其游動活性。先將斑馬魚放進行為室中適應10 min后，觀察仔魚對環境由黑暗到光明再到黑暗轉變(10 min暗—10 min光—10 min暗—10 min光—10 min暗)的響應情況，每30 s記錄一次數據(包括移動頻率、行進距離和累計持續移動時間)。

1.6 氧化應激相關酶測定

將斑馬魚胚胎暴露120 hpf后，加入PBS制成10%的組織勻漿，于4 ℃、2 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至冰浴預冷的離心管中。按照試劑盒說明書檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力。

1.7 組織內Ca2+及γ-氨基丁酸含量測定

TBBPA-DHEE暴露120 hpf后，將仔魚清洗干凈，加入PBS制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，根據試劑盒說明書測定其Ca2+含量和斑馬魚γ-氨基丁酸含量。

1.8 qRT-PCR法測定Ca2+信號通路中相關mRNA表達

仔魚暴露120 hpf后，每組隨機選取30條仔魚，根據RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，用超微量核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度。取1 μg RNA采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA。根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書加入樣品和試劑進行PCR擴增，實驗反應體系為20 μL，包括1 μL DNA模板及0.2 μL上、下游混合引物；反應程序:95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，共55個循環；熔融曲線反應條件：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。PCR引物設計由上海生工生物工程股份有限公司設計，選取β-actin作為內參基因，Cacna1ab、Atp2a1、Atp2a1l、Camk1ga、Calml4a、Ppp3ca、Plcd3a和Prkca的引物設計如表1所示。目的基因表達水平用2-ΔΔCt法進行計算處理。

表1 Ca2+通路相關基因引物

1.9 數據分析

2 結果

2.1 斑馬魚胚胎/仔魚形態的變化

如圖1A所示，與空白對照組相比，TBBPA-DHEE各劑量組斑馬魚胚胎死亡率呈上升趨勢，且8.600 mg/L暴露劑量組顯著上升(P<0.05)。由此可見，TBBPA-DHEE暴露可致斑馬魚死亡率升高。

如圖1B所示，與空白對照組相比，72 hpf時TBBPA-DHEE各暴露劑量組胚胎孵化率呈下降趨勢，且0.860 mg/L暴露劑量組孵化率顯著下降(P<0.05)；96 hpf時，0.860 mg/L劑量組孵化率較空白對照組顯著降低(P>0.05)。由此可見，TBBPA-DHEE暴露可導致胚胎孵化延遲。

如圖1C所示，斑馬魚胚胎畸形率隨TBBPA-DHEE濃度增加而上升，各暴露劑量組仔魚出現心包水腫、身體彎曲、游囊關閉等畸形形態，且與空白對照組相比，8.600 mg/L暴露劑量組畸形率顯著上升(P<0.05)。由此可見，TBBPA-DHEE暴露劑量增加可增加仔魚畸形率，影響其正常發育。

如圖1D所示，72 hpf時，隨著暴露劑量升高，心率變化呈倒“U”型變化趨勢，即低劑量增強心率而高劑量抑制心率，與空白對照組相比，8.600 mg/L暴露劑量組仔魚心率顯著降低10.7%(P<0.01)。由此可見，TBBPA-DHEE暴露可致斑馬魚心臟發育受損，血液循環減緩，營養物質運輸受阻，進一步影響斑馬魚胚胎的發育。

如圖1E所示，96 hpf時，各暴露劑量組斑馬魚仔魚平均體長呈劑量-效應關系，8.600 mg/L暴露劑量組中的斑馬魚仔魚平均體長顯著低于空白對照組(P<0.05)。由此可見，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制仔魚正常生長發育。

A:96 hpf時斑馬魚胚胎/仔魚的死亡率；B:72和96 hpf時斑馬魚胚胎的孵化率；C:96 hpf時斑馬魚胚胎/仔魚畸形率及畸形形態；D:48和72 hpf時斑馬魚胚胎/仔魚的心率；E:96 hpf時斑馬魚仔魚的平均體長。a: P < 0.05， b: P<0.01，與空白對照組比較圖1 各組斑馬魚胚胎/仔魚的形態學變化

2.2 斑馬魚胚胎/仔魚行為的變化

2.2.1 胚胎早期自主運動分析 TBBPA-DHEE暴露對斑馬魚胚胎早期自主運動次數的影響如圖2所示。暴露于0.086、0.860和8.600 mg/L劑量TBBPA-DHEE中的胚胎，其運動次數較空白對照組分別下降44.92%，66.95%和83.90%(P<0.01)。自主運動是影響胚胎孵化的因素之一，其與胚胎孵化結果一致。由此表明，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制胚胎早期運動。

*:P < 0.01，與空白對照組比較圖2 各組斑馬魚胚胎的早期自主運動次數

2.2.2 仔魚的運動行為分析 圖3A所示，空白對照組斑馬魚仔魚在明暗刺激下，運動活力呈周期性變化，即開燈時(黑暗轉為明亮)仔魚的運動活力迅速下降，而關燈時(明亮轉為黑暗)仔魚的運動活力迅速上升，在黑暗條件下仔魚的平均運動距離高于光照條件下的平均運動距離。

圖3B所示，黑暗條件下，0.860和8.600 mg/L暴露劑量組的運動活力較空白對照組顯著降低(P<0.01)，光照條件下各暴露劑量組與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。圖3C所示，與空白對照組相比，黑暗期下0.860和8.600 mg/L暴露劑量組仔魚累計持續移動時間顯著降低(P<0.01)，光照期下各暴露劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

A:暗—明—暗—明—暗光照周期刺激下斑馬魚平均游泳距離；B:明暗刺激下相應的平均游泳距離；C:光暗周期下斑馬魚仔魚累計持續移動時間。*:P<0.01，與空白對照組比較圖3 120 hpf時各組斑馬魚的運動行為變化

2.3 斑馬魚體內氧化應激相關酶的變化

如圖4A所示，與空白對照組相比，各暴露劑量組仔魚體內SOD活力均呈上升趨勢；0.086和8.600 mg/L暴露劑量組SOD活力分別提高28.48%和20.66%(P<0.01)；0.860 mg/L暴露劑量組SOD活力提高7.90%(P<0.05)。如圖4B所示，與空白對照組相比，各暴露劑量組斑馬魚體內丙二醛含量呈濃度-效應關系，0.860 mg/L和8.600 mg/L暴露劑量組丙二醛含量分別提高62.68%(P<0.05)和99.56%(P<0.01)。如圖4C所示，120 hpf時各濃度TBBPA-DHEE暴露劑量組GPx活力與空白對照組相比呈上升趨勢，0.860和8.600 mg/L暴露劑量組分別上升111.73%和173.94%(P<0.01)。由此表明，TBBPA-DHEE暴露可造成斑馬魚仔魚機體氧化應激損傷，影響斑馬魚仔魚的神經系統。

A:斑馬魚仔魚體內SOD活力；B:斑馬魚仔魚體內丙二醛含量；C:斑馬魚仔魚體內GPx活力。a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對照組比較圖4 各組斑馬魚體內氧化應激相關酶的活性及含量

2.4 斑馬魚體內Ca2+及γ-氨基丁酸含量的變化

圖5A和5B所示，隨著TBBPA-DHEE暴露劑量的增加，斑馬魚仔魚Ca2+含量呈上升趨勢，γ-氨基丁酸含量呈下降趨勢。與空白對照組相比，0.860和8.600 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE可顯著增加Ca2+含量，分別升高34.85%和55.79%(P<0.05或<0.01)；各暴露劑量組斑馬魚仔魚γ-氨基丁酸含量顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見，TBBPA-DHEE可顯著增加斑馬魚體內Ca2+含量，降低γ-氨基丁酸含量，產生神經毒性。

A:斑馬魚仔魚體內Ca2+含量；B:斑馬魚仔魚體內γ-氨基丁酸含量。a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對照組比較圖5 各組斑馬魚體內Ca2+及γ-氨基丁酸的含量

2.5 Ca2+信號通路中相關mRNA表達量的變化

如圖6所示，與空白對照組相比，0.860 mg/L和8.600 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE均顯著上調仔魚Cacna1ab、Atp2a1、Atp2a1l、Camk1ga、Ppp3ca、Plcd3a和Prkca等mRNA表達(P<0.05或<0.01)；0.086 mg/L暴露劑量TBBPA-DHEE顯著下調Atp2a1和Plcd3a表達(P<0.05或<0.01)。可見，TBBPA-DHEE可顯著影響Ca2+信號通路相關mRNA表達。

a:P<0.05，b:P<0.01，與空白對照組比較圖6 各組斑馬魚仔魚體內Ca2+通路中相關mRNA表達量比較

3 討論

斑馬魚胚胎的自發運動能夠反映斑馬魚的神經元活力。17～29 hpf時胚胎出現早期自主運動，其表現為尾巴交替擺動。28～29 hpf時，隨著中樞系統的發育，胚胎早期自主運動受到自發控制，此階段運動頻率趨于穩定[7]。本研究結果表明，TBBPA-DHEE暴露可顯著抑制胚胎的自發運動。在生命早期階段，斑馬魚仔魚的運動行為常作為神經系統發育的評價指標，行為受外在環境干擾，對環境污染物比較敏感。本研究結果表明，TBBPA-DHEE暴露顯著抑制黑暗條件下斑馬魚的運動活力及累計持續移動時間，且降低仔魚對光暗刺激的敏感性。先前的研究中，200和400 μg/L TBBPA暴露可顯著降低斑馬魚仔魚在光照期和黑暗期運動活力[1]，本實驗結果與其一致，表明TBBPA-DHEE與TBBPA具有相似的神經毒性，均對斑馬魚仔魚神經系統造成影響。

氧化應激可破壞機體內活性氧與抗氧化系統間的平衡，影響神經突觸的可塑性[8]，是引起興奮性毒性的重要因素。氧化與抗氧化系統間的失衡將影響斑馬魚胚胎的發育。SOD和GPx作為抗氧化酶，在保護細胞免受氧化應激中起重要作用。脂質過氧化是氧化損傷的主要表現之一，丙二醛是衡量機體脂質過氧化的標志性檢測之一，其含量間接反映膜損傷程度。本研究結果表明，TBPPA-DHEE暴露顯著增加斑馬魚體內SOD、GPx活力，這可能是一種機體應激反應；丙二醛含量顯著上升，表明TBBPA-DHEE暴露對機體造成氧化損傷。Linhartova等[9]發現，斑馬魚暴露于TBBPA中，體內SOD活力呈上升趨勢；左優[10]將斑馬魚暴露在TBBPA中，其體內GPx活力顯著升高；Zhang等[11]研究發現，TBBPA暴露會導致斑馬魚體內丙二醛含量顯著增加；本研究結果均與上述研究類似，表明TBBPA-DHEE與TBBPA具有相似的氧化應激反應，影響斑馬魚仔魚神經系統。

Ca2+作為第二信使，在細胞信號傳遞過程中起重要作用，參與去極化信號的傳輸和突觸傳遞、調節細胞凋亡、學習記憶等生物過程[12]。TBBPA-DHEE暴露可誘導斑馬魚仔魚體內Ca2+含量增加，Ca2+失衡會誘導氧化應激、線粒體去極化和細胞毒性，同時引起神經毒性[13]。過量的Ca2+內流和快速升高可誘導神經元不可逆損傷，本研究結果表明TBBPA-DHEE可破壞機體內的鈣穩態。γ-氨基丁酸是中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質[14]。本研究發現，隨著TBBPA-DHEE劑量增加，仔魚體內γ-氨基丁酸含量呈下降趨勢。由此表明，TBBPA-DHEE對機體內神經遞質的攝取產生影響，從而產生神經毒性。

CaV2.1b(Cacna1ab)由感覺神經元表達，在細胞活動依賴性神經遞質釋放過程中，可將Ca2+信號傳導到突觸前末梢[15]。Atp2a1和Atp2a1l調控的肌漿/內質網Ca2+-ATP酶在Ca2+跨膜運輸中起重要作用，有助于將Ca2+重新隔離至肌漿網中，促使肌肉放松[16]。本研究結果表明，與空白對照組相比，高劑量TBBPA-DHEE暴露顯著上調Cacna1ab、Atp2a1和Atp2a1lmRNA表達。Camk1ga調控的鈣調素主要存在于脊椎動物中樞神經系統中，富集于突觸后膜、突觸后致密區及突出囊泡，CAMK屬于鈣調素激酶家族。當Ca2+濃度上升時，先與鈣調素結合，而后激活CAMK[17]。Ppp3ca調控的鈣調神經磷酸酶是一種Ca2+鈣調蛋白調節蛋白磷酸酶，在Ca2+信號傳導與細胞反應的耦合中起關鍵作用[18]，是一種負性調控學習記憶蛋白，上調時可導致學習記憶受損。Ppp3ca可能與癲癇神經發育障礙有關。Plcd3a調控的PLC是磷酸肌醇途徑中的關鍵酶，通過生成二酰基甘油和肌醇1,4,5-三磷酸，介導激活蛋白激酶C，且調節釋放細胞內的Ca2+；研究發現其與神經退行性疾病和阿爾茨海默病有關[19]。本研究結果表明，TBBPA-DHEE暴露誘導Camk1ga、Ppp3ca、Plcd3a和PrkcamRNA表達上升。由此可見，TBBPA-DHEE暴露可激活斑馬魚仔魚鈣信號通路從而產生神經毒性。

綜上所述，TBBPA-DHEE暴露可致胚胎/仔魚死亡率和畸形率升高，延緩胚胎孵化，對斑馬魚運動行為產生顯著影響，同時引起斑馬魚仔魚體內SOD、GPx活力及丙二醛含量顯著上升，造成氧化損傷，產生神經毒性，可能與TBBPA-DHEE暴露誘導仔魚體內 Ca2+含量上升，破壞鈣穩態，抑制攝取γ-氨基丁酸，并影響斑馬魚仔魚Ca2+信號通路相關mRNA的表達相關。