寨卡病毒非結構蛋白1對小鼠免疫應答的影響

榮小榮 楊延鵬 趙 丹 王垣芳

1 濱州醫學院藥學院 山東 煙臺 264003；2 聊城市第四人民醫院 山東 聊城 252000

近幾年來，由寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)感染引起的ZIKV病在全世界諸多地區暴發流行[1-2]，引起全球廣泛關注。ZIKV感染除了引起發熱、皮疹、關節疼痛、無力等癥狀外，還會對感染者的神經系統造成損害，孕婦感染可能導致胎兒畸形[1,3-5]。目前對于ZIKV病尚無特效的抗病毒藥物和成熟的疫苗面市[6-8]，因此研發特效的抗ZIKV藥物和有效的ZIKV疫苗是亟待解決的問題。

ZIKV非結構蛋白1(Non-structural protein 1，NS1)在病毒復制、致病機制及免疫逃逸中起著關鍵作用，可誘導機體產生抗體，是該病毒感染的主要抗原[9]。有研究發現，采用ZIKV-NS1 DNA疫苗候選物接種于小鼠可使小鼠免受ZIKV感染，提示NS1單獨使用可能具有保護機體免受ZIKV感染的作用[10]。本實驗采用pET28a-ZIKV-NS1原核質粒表達得到重組NS1，并將其接種于小鼠，通過檢測小鼠血清IgG抗體、淋巴細胞亞群及細胞因子觀察其對小鼠免疫應答的影響，探討NS1作為ZIKV疫苗的潛力，為ZIKV疫苗的研發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質粒 大腸埃希菌E.coli Rosetta(DE3)為實驗室留存；感受態細胞DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；原核質粒pET-28a購自美國Novagen公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶BamHI/HindIII購自英國NEB公司；流式細胞術檢測相關抗體(CD3+-APC/Cy7、CD4+-FITC、CD8+-PerCP、IFN-γ -APC、IL-4 -PE及IFN-γ測試盒(2210006)及IL-4(2210403)測試盒(達科為生物技術有限公司)；Anti-ZIKV Virus NS1 antibody[B4](Abcam，批號為ab218546)；HRP標記兔抗鼠IgG(二抗)(北京潤澤康生物科技有限公司，批號為C2210)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號為P0012)。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(MyCyclerTM)，Bio-Rad公司；核酸電泳儀(DYY-III-6B)，北京六一儀器；凝膠成像系統(AlphalmagerTM 2200)，Alpha公司；流式細胞儀(LSRFortessa)，BD公司。

1.1.4 實驗動物 6～8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠，體質量為16～20 g，購自青島派特福德白鼠養殖專業合作社，合格證號為SCXKL(魯)20140007。

1.2 方法

1.2.1 ZIKV-NS1特異性引物的設計 通過基因合成得到ZIKV-NS1基因(Gene-Bank序列號KU963796.1)，運用Primer 5.0軟件設計上下游引物，在上下游分別插入酶切位點BamHI和HindIII，片段NS1全長1 056 bp，引物信息如下：

ZIKV-NS1-F：5′-CGCGGATCCATGGATGTGGGGTGCTCGGTGGA-3′，

ZIKV-NS1-R：5′-CCCAAGCTTTTATGCAGTCGACCATTGACCTT-3′。

1.2.2 PCR擴增目的片段 以ZIKV-NS1基因為模板，ZIKV-NS1-F/ZIKV-NS1-R為引物，進行PCR擴增。反應條件為：98℃預變性5 min；98℃變性30 s，68℃退火30 s，68℃延伸1 min，循環30次；68℃延伸10 min后結束；16℃存放。將得到的PCR產物上樣于凝膠電泳儀進行跑膠得到目的條帶，對目的條帶進行切膠回收，再應用膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 pET28a-ZIKV-NS1構建與鑒定 應用限制性內切酶BamHI和HindIII對質粒和目的片段進行雙酶切，酶切后的目的片段和質粒進行回收，用T4 DNA ligase連接，得到重組質粒(圖1)，提取重組質粒后送測序并鑒定，確定重組質粒為pET28a-ZIKV-NS1，將質粒轉化至表達菌感受態細胞BL21(DE3)。

PT7.T7啟動子；His6.多組氨酸標簽；TT7.T7終止子。圖1 ZIKV-NS1基因質粒構建示意圖

1.2.4 ZIKV-NS1表達、純化及鑒定 將鑒定正確的陽性菌落接種于LB培養基，震蕩培養至菌液在600 nm處的吸光值在0.4～0.6之間，加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導NS1的表達，在20℃下繼續培養18 h。離心收集菌體后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸，之后應用超聲破碎菌體收集沉淀得到目的蛋白。對于包涵體蛋白采用8M尿素變性，透析復性的方法得到上清，因目的蛋白偶聯His6標簽，應用親和層析法分離蛋白，將上清與柱子充分結合，經鎳柱多次親和掛柱及梯度咪唑洗脫后得到目的蛋白，將得到目的蛋白經BCA蛋白濃度定量試劑盒測定終得率約5 mg/L菌液，取樣用于SDS-PAGE分析及Western Blot鑒定。最后，將目的蛋白溶解于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，分裝后凍存于-80℃冰箱保存備用，避免反復凍融。

1.2.5 ZIKV-NS1小鼠免疫及標本采集 將10只小鼠隨機分為空白對照組和實驗組，每組5只。給空白對照組小鼠肌內注射PBS(100 μL/只)，實驗組小鼠肌內注射NS1(20 μg/只)進行免疫，每隔14 d注射1次，共注射3次。第1次和第2次注射1周后行內眥部取血，第3次注射1周后行摘眼球取血，將所采血液37℃靜置2 h后以5 000 r/min離心5 min制得血清，每只小鼠均取20 μL血清進行效價檢測。上述實驗重復3次，總共使用小鼠30只。

1.2.6 小鼠血清IgG效價檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定，以PBS組為空白對照組，用純化的ZIKV-NS1包被酶標板(終濃度為1 μg/mL)，每孔中加入100 μL稀釋好的蛋白溶液，4℃包被過夜，PBST洗板2～3次，每次300 μL，5%脫脂牛奶37℃封閉2 h備用。提前將采集好的小鼠血清用含有1%脫脂牛奶的稀釋液1∶32倍起進行2倍梯度稀釋，用稀釋后的血清作為一抗進行孵育，兔抗鼠IgG抗體(HRP標記)為二抗，3次洗板后進行TMB顯色，應用2M硫酸50 μL /孔作為終止液終止顯色。應用酶標儀在450 nm處檢測吸光值，相同稀釋倍數下以實驗組數據大于空白對照組數據2.1倍以上為陽性結果，以陽性血清的最高稀釋倍數表示抗體效價。

1.2.7 脾臟CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平檢測 將小鼠摘眼球取血后，取出脾臟加入淋巴細胞分離液，置于200目尼龍網上研磨，離心后分離得到淋巴細胞。將空白對照組(PBS)與實驗組(NS1)均分為兩組，第1組細胞不加入NS1直接應用流式細胞儀檢測，檢測出1萬個細胞中CD4+、CD8+細胞數量及分泌IFN-γ、IL-4的細胞數量，分別定義為空白對照組(PBS)-未刺激(組1)和實驗組(NS1)-未刺激(組2)。同時利用24孔板進行細胞培養，將第2組細胞每孔約5×105個細胞進行鋪板，每孔加入20 μg NS1，每孔額外加入monensin 2 μmol/L(蛋白轉運抑制劑)，37℃孵育4 h后應用流式細胞儀檢測1萬個細胞中相同淋巴細胞亞群和相同細胞因子的細胞數量，分別定義為空白對照組(PBS)-刺激(組3)和實驗組(NS1)-刺激(組4)。應用Flowjo7.6軟件分析流式數據，測定CD4+、CD8+細胞數量及分泌IFN-γ、IL-4的細胞數量占樣本中所有細胞的百分比。之后應用酶聯免疫斑點測定法(ELISPOT)測定NS1特異性分泌IFN-γ、IL-4的細胞數量。

2 結果

2.1 ZIKV-NS1基因PCR擴增與重組質粒鑒定 以合成序列為模板PCR擴增后跑膠出現條帶約為1 056bp，與合成目的序列大小相同。將質粒與目的片段進行雙酶切，酶切后用T4 DNA ligase連接，得到重組質粒，對重組質粒進行雙酶切驗證，可見2條明顯條帶，大條帶約為5 369 bp，與質粒大小相當；小條帶約為1 056 bp，與目的序列大小相當，見圖2。

A. ZIKV-NS1基因PCR擴增；B. pET28a-ZIKV-NS1質粒雙酶切鑒定。M. DNA標志物；A1. ZIKV-NS1基因PCR產物；B1. 重組質粒雙酶切鑒定。圖2 ZIKV-NS1基因PCR擴增與重組質粒鑒定

2.2 重組NS1的表達純化與鑒定 純化所得蛋白經SDS-PAGE分析，在44 kD處有單一條帶，經Western Blot 鑒定能與Anti-ZIKV-NS1抗體特異性結合，所得蛋白為重組ZIKV-NS1，單一條帶用Image J軟件進行灰度比較分析，灰度值高于85%，表明純化得蛋白單一。蛋白經Western blot 鑒定能與Anti-ZIKV-NS1及His標簽抗體特異性結合，所得蛋白為重組ZIKV-NS1，見圖3。

A. ZIKV-NS1的SDS-PAGE分析；B和C. 重組ZIKV-NS1的Western blot 鑒定。M. 蛋白分子質量標準；1. 純化的目的蛋白。圖3 重組NS1的表達純化與鑒定

2.3 小鼠血清IgG效價 空白對照組3次注射PBS后分別檢測血清IgG效價，結果顯示抗體效價水平均較低，3次結果均無明顯變化。實驗組小鼠初次NS1免疫后血清IgG抗體效價較低，第2次和第3次免疫后IgG效價明顯升高，第3次免疫后IgG效價可達1∶18 000。實驗組小鼠第2次和第3次免疫后IgG效價顯著高于空白對照組，P<0.001，見圖4。

2.4 小鼠脾臟CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平 實驗組(NS1)-刺激(組4)CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4的分泌水平均上升，與實驗組(NS1)-未刺激(組2)比較，P<0.01；實驗組(NS1)-刺激(組4)CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4的分泌水平上升，與空白對照組(PBS)-刺激(組3)比較，P<0.01，見表1，圖5、6。

與空白對照組相比，***P<0.001。圖4 小鼠血清IgG效價

表1 小鼠脾臟CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平

圖5 小鼠脾臟CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平

與空白對照組(PBS)-刺激比較，***P<0.001。圖6 小鼠脾臟CD4+、CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平

2.5 小鼠脾臟IFN-γ、IL-4分泌型細胞數量 實驗組(NS1)小鼠脾臟IFN-γ分泌型T細胞斑點數量為每百萬個細胞約135個，IL-4分泌型T細胞斑點數量為每百萬個細胞約25個，空白對照組(PBS)無斑點，二者比較，P<0.001，見圖7。

與空白對照組(PBS)比較，***P<0.001。圖7 小鼠脾臟IFN-γ和IL-4分泌型細胞數量

3 討論

ZIKV的非結構蛋白NS1是ZIKV感染的主要抗原，在病毒復制、致病機制和免疫逃逸中起著關鍵作用[9]。對于NS1的研究需選擇適宜的蛋白表達系統，目前常用的有大腸桿菌表達系統和桿狀病毒表達系統。桿狀病毒表達系統周期長哺乳動物細胞表達系統表達量低、成本高[11-16]，而大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、周期短、表達量高、成本低等優點，因此本實驗采用大腸桿菌原核系統誘導表達NS1，經SDS-PAGE分析及Western Blot鑒定表明重組NS1成功。

人體免疫應答包括體液免疫和細胞免疫。體液免疫是以B細胞產生抗體來達到保護目的，因此對抗體效價的測定是檢查體液免疫的主要指標，其中IgG抗體可發揮持久的保護作用，是動物機體抗感染的主力。細胞免疫是T細胞借由釋放淋巴因子而發揮免疫力的免疫，而T細胞功能取決于T淋巴細胞總值(CD3+細胞)及其亞群(CD4+細胞、CD8+細胞)的相對組成[17]，正常情況下，亞群間互相拮抗達成平衡。因此T淋巴細胞計數及其亞群和細胞因子等是判斷機體細胞免疫水平的重要指標。

IgG抗體是人體最重要的抗病原微生物抗體，能與病毒抗原結合，從而使病毒失去感染細胞的能力，且能夠激活補體效應，誘導被感染細胞死亡，使其中的病毒也隨之被清除[18-19]。本實驗結果顯示，給小鼠肌內注射NS1免疫 2次和3次后IgG效價升高，且隨免疫次數的增加而升高，表明NS1可刺激機體產生IgG抗體，具有激活體液免疫的作用。

CD4+細胞、CD8+細胞及IFN-γ、IL-4等細胞因子在機體細胞免疫方面起著關鍵作用，是目前篩選病毒免疫原蛋白的主要指標[17,20]。當機體受到病毒感染時，CD4+細胞可輔助CD8+細胞參與機體細胞免疫應答，清除體內被病毒感染的異常細胞從而保護機體正常組織細胞免遭病毒侵襲，兩個亞群比例可因此發生改變。機體免疫系統可通過細胞因子進行調節，IFN-γ、IL-4等細胞因子是免疫調節的關鍵物質之一[20]。其中IFN-γ是Th1細胞的代表性細胞因子，是一種高效的抗病毒生物活性物質，具有廣泛免疫調節作用，包括誘導多種抗原提呈細胞表達MHC-I/II分子，活化單核、巨噬細胞、中性粒細胞和NK細胞，促進Th1細胞發育和抑制Th2細胞活化與增殖，刺激B細胞產生的抗體類型向調理素方向轉變[21]。IL-4是Th2細胞的代表性細胞因子，可刺激B細胞和T細胞增殖，在調節體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用[22]。本實驗結果顯示，NS1能使小鼠脾臟CD4+和CD8+細胞數量增加，提示NS1具有激活細胞免疫的作用；NS1能使IFN-γ、IL-4分泌水平升高，且NS1特異性IFN-γ分泌型T細胞斑點數量較IL-4的細胞斑點數量升高更明顯(分別為每百萬個細胞約為135和25個)，提示ZIKVNS1促進Th1/Th2細胞平衡向Th1細胞偏移，以Th1型細胞介導的細胞免疫為主。

近年來對于NS1免疫原的研究多側重于體液免疫[15-16]，而對于NS1對細胞免疫的影響研究甚少，本實驗通過重組蛋白NS1從體液免疫和細胞免疫兩個方面進行了研究。前期Grubor等[10]研究發現NS1-DNA疫苗候選物可通過增強小鼠細胞免疫功能從而抵抗ZAKV感染，與本研究中NS1可激活小鼠細胞免疫是一致的。但目前多數國家核酸疫苗研發技術基礎薄弱，安全性未知，且在高等動物體內難以誘導較強的免疫應答[23]，而重組蛋白疫苗研發技術已較成熟，且安全、高效、投入生產和應用的效率會更高。

ZIKV屬于黃病毒屬，黃病毒屬病毒基因組編碼至少三種結構蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和七種非結構蛋白，其中E蛋白是病毒的重要抗原成分[24]。目前對于黃病毒疫苗的研發主要是應用黃病毒E蛋白激活體液免疫[7-9,25]。某些黃病毒E蛋白相似的基因序列和結構同源性可導致高度的抗體交叉反應性，并導致感染的抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement，ADE)[26]。有研究顯示，以傳統黃病毒E蛋白構建的重組腺病毒載體疫苗中插入NS1基因能夠明顯增強疫苗的保護效力[27-29]，且黃病毒NS1上存在多個特異性的抗原表位，由此推測，NS1可能會通過激活機體免疫系統而增強E蛋白載體疫苗的保護效果，且NS1不表達于病毒粒表面，不會引起ADE[28,30-31]。

本實驗通過原核表達系統表達并純化得到ZIKVNS1，并使用NS1對小鼠進行免疫，結果顯示NS1能使小鼠血清IgG效價顯著升高、脾臟CD4+和CD8+細胞數量及IFN-γ、IL-4分泌水平升高，提示NS1對小鼠體液免疫和細胞免疫均具有激活效應，NS1具有成為ZIKV疫苗的可能性；與近年來ZIKV NS1-DNA疫苗的研發思路不同，本研究可能為ZIKV疫苗和黃病毒疫苗的研發提供了新的思路。