成熟度對(duì)不同烤煙品種烘烤過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)含量及PPO活性變化的影響

李曉輝，甄煥菊，牛慧偉，李雪利，趙銘欽，典瑞麗

（1.中國(guó)煙草總公司職工進(jìn)修學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002）

煙葉采收成熟度是衡量煙葉生產(chǎn)和質(zhì)量的核心指標(biāo)，影響并決定著煙葉的加工價(jià)值［1］。烘烤是烤煙生產(chǎn)中決定煙葉最終質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。在調(diào)制過(guò)程中，多酚類(lèi)物質(zhì)的代謝特性對(duì)烤后煙葉顏色和等級(jí)產(chǎn)生重要影響［3］，研究不同采收成熟度對(duì)煙葉多酚類(lèi)物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性的影響，對(duì)于提升煙葉烘烤質(zhì)量具有重要作用。

多酚類(lèi)化合物是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)［4］。王昇等［5］研究表明，煙草中多酚含量與煙草品質(zhì)呈正相關(guān)，成熟度是影響煙葉多酚類(lèi)物質(zhì)含量的重要影響因素之一。在烘烤過(guò)程中，煙葉中的多酚類(lèi)物質(zhì)，如綠原酸、蕓香苷等在多酚氧化酶的作用下，經(jīng)氧化產(chǎn)生淡紅色至黑褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，使煙葉顏色由黃轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌潭鹊暮稚?］。王傳義等［7］研究表明，隨著成熟度的提高，PPO活性在煙葉調(diào)制過(guò)程中會(huì)隨之降低，而PPO活性較低，棕色化發(fā)應(yīng)就不易發(fā)生；成熟度不夠的煙葉在46℃左右時(shí)PPO活性突然升高，而成熟度過(guò)高的煙葉，44℃以后酶活性迅速降低。成熟度偏低或偏高都增加了棕色化反應(yīng)的可能性，降低煙葉的多酚類(lèi)物質(zhì)含量［8-10］。所以，合理地掌握煙葉采收成熟度，能夠有效調(diào)控?zé)熑~PPO活性，減少多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化。以往對(duì)成熟度的研究大多集中在對(duì)烤煙產(chǎn)質(zhì)量的影響，而關(guān)于成熟度對(duì)不同烤煙品種烘烤過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)含量及PPO活性變化的影響研究較少。本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)采收成熟度，種植5個(gè)烤煙品種，研究品種、成熟度及其互作對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)含量及PPO活性變化的影響，進(jìn)而把握不同烤煙品種合適的采收成熟度，以提高煙葉多酚物質(zhì)含量，為提高煙葉烘烤質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87（CK）、云煙105、RY21、NC71和渠首1號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年在河南省南陽(yáng)市方城縣金葉園進(jìn)行。試驗(yàn)田為黃壤土，肥力中等，按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范化栽培管理。選取大田管理規(guī)范、個(gè)體與群體生長(zhǎng)發(fā)育協(xié)調(diào)一致、落黃均勻的優(yōu)質(zhì)煙田開(kāi)展成熟度研究。

試驗(yàn)選5個(gè)品種煙株中部葉（從底部向上數(shù)12～14片），并依其成熟度設(shè)置3個(gè)處理（表1），共計(jì)15個(gè)處理，重復(fù)3次。采用溫濕度自控烤箱，將不同品種不同成熟度煙葉裝在同一烤箱內(nèi)相同位置烘烤。

表1 不同處理鮮葉的采收成熟度標(biāo)準(zhǔn)

1.3 取樣與測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 酶活性 于烘烤過(guò)程中每24 h取樣1次，每次取10片煙葉，切去葉尖和基部各1／3區(qū)域，留葉中間1／3區(qū)域，采用鄰苯二酚氧化法［11］測(cè)定PPO活性，所有處理重復(fù)3次。

1.3.2 多酚類(lèi)物質(zhì) 于烘烤過(guò)程中每24 h取樣1次，每次取10片煙葉，切去葉尖和基部各1／3區(qū)域，留葉中間1／3區(qū)域，于105℃殺青15 min、60℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩后保存，用作多酚類(lèi)指標(biāo)的測(cè)定。綠原酸、蕓香苷和莨菪亭等多酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定采用YC／T 202—2006［12］標(biāo)準(zhǔn)，所有處理重復(fù)3次。總酚含量為綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量之和。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烤煙品種及成熟度對(duì)烘烤過(guò)程中多酚氧化酶（PPO）活性的影響

由表2可知，烘烤期間煙葉的PPO活性在不同成熟度、品種及其互作間的差異均達(dá)到1%顯著水平。0～96 h，煙葉PPO活性成熟度間的差異大于品種間、成熟度與品種互作間的差異，說(shuō)明成熟度對(duì)PPO活性的影響作用最大，其次為品種，兩者互作影響最小。

由圖1可知，各個(gè)成熟度煙葉在烘烤過(guò)程中的PPO活性整體呈現(xiàn)為：0～48 h下降，48～72 h迅速上升，之后逐漸下降并維持在較低水平。24～48 h，3個(gè)成熟度間煙葉PPO活性差異顯著；72 h時(shí)未熟煙葉的PPO活性最高，分別是適熟、過(guò)熟煙葉PPO活性的1.28倍、1.54倍，且差異達(dá)到顯著水平；96 h時(shí)煙葉PPO活性表現(xiàn)為未熟＞適熟＞過(guò)熟。

表2 烘烤過(guò)程中煙葉多酚氧化酶（PPO）活性的方差分析

圖1 不同成熟度煙葉烘烤過(guò)程中多酚氧化酶（PPO）活性變化

如圖2所示，5個(gè)品種煙葉的PPO活性也有差異。0～48 h，PPO活性逐漸下降，48～72 h迅速攀升且72 h時(shí)出現(xiàn)峰值，之后迅速下降。鮮煙葉的PPO活性表現(xiàn)為云煙105＞RY21＞渠首1號(hào)＞云煙87＞NC71；變黃期（24～48 h），云煙105和RY21酶活性較高，且差異不顯著，渠首1號(hào)酶活性最低；定色期（72 h），云煙105和RY21保持較高的酶活性，云煙87和NC71酶活性最低；96 h時(shí)，PPO活性表現(xiàn)為NC71＞云煙105＞RY21＞云煙87＞渠首1號(hào)。相對(duì)其它品種，渠首1號(hào)和云煙87整個(gè)烘烤過(guò)程中其酶活性較低且變化較為平穩(wěn)。

2.2 不同烤煙品種及成熟度對(duì)烘烤過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)的影響

2.2.1 煙葉總酚的方差分析及含量變化 由表3可知，整個(gè)烘烤過(guò)程中煙葉總酚含量在不同品種、成熟度及其互作間差異均達(dá)到1%顯著水平。其中成熟度作用在初烤（0h）和后期（96h）影響最大，品種作用則在24～72 h間影響最大，0～96 h成熟度與品種互作影響最小。

圖2 不同烤煙品種烘烤過(guò)程中多酚氧化酶（PPO）活性變化

由圖3可知，隨著烘烤的推進(jìn)，總酚含量在0～48 h間上升，72 h時(shí)緩慢下降，之后上升直到烘烤結(jié)束，烤后總酚含量明顯高于烤前。整個(gè)烘烤時(shí)期總酚含量始終表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟，且各個(gè)成熟度間總酚含量差異顯著。烘烤結(jié)束時(shí)，適熟煙葉的總酚含量最高，是未熟、過(guò)熟煙葉的1.09倍、1.04倍。

圖3 不同成熟度對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中總酚含量的影響

表3 烘烤過(guò)程中煙葉多酚類(lèi)物質(zhì)的方差分析

由圖4可知，不同品種間總酚含量有差異：初烤時(shí)總酚含量表現(xiàn)為云煙87＞RY21＞渠首1號(hào)＞云煙105＞NC71；變黃期（24～48 h），云煙87總酚含量最高，渠首1號(hào)含量最低，RY21和NC71差異不顯著；定色期（72 h），各品種總酚含量均有一定程度的下降，表現(xiàn)為云煙87＞NC71＞RY21＞云煙105＞渠首1號(hào)；96 h時(shí)各品種總酚含量有明顯上升，但品種間差異未達(dá)到顯著水平。

圖4 不同烤煙品種烘烤過(guò)程中總酚含量變化

2.2.2 煙葉綠原酸的方差分析及含量變化 由表3可知，整個(gè)烘烤過(guò)程中煙葉綠原酸含量在不同品種、成熟度及其互作間差異均達(dá)到1%顯著水平。其中成熟度作用在初烤（0 h）和后期（96 h）影響最大，品種作用則在24～72 h影響最大，0～96 h成熟度與品種互作影響最小。

由圖5可知，隨著烘烤的推進(jìn)，綠原酸含量在0～48 h間上升，72 h時(shí)緩慢下降，之后上升直到烘烤結(jié)束，不同成熟度間變化趨勢(shì)一致。3個(gè)成熟度鮮煙的綠原酸含量差異顯著且表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟；24～48 h，綠原酸含量逐漸升高，適熟煙葉綠原酸含量最高，未熟和過(guò)熟煙葉綠原酸含量差異不顯著；48～72 h，綠原酸含量有一定程度的下降，降幅表現(xiàn)為適熟＞未熟＞過(guò)熟；72～96 h，綠原酸含量大幅上升，且表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟。

圖5 不同成熟度對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中綠原酸含量的影響

由圖6可知，不同品種間綠原酸含量存在差異，表現(xiàn)為：0 h時(shí)，RY21＞云煙105＞云煙87＞NC71＞渠首1號(hào)，但差異不顯著；24 h時(shí)，云煙105、云煙87和RY21綠原酸含量較高，且差異不顯著，渠首1號(hào)含量最低；48 h時(shí)，云煙105、云煙87綠原酸含量較高，且差異不顯著，渠首1號(hào)含量也最低；72 h時(shí)不同品種綠原酸含量表現(xiàn)為NC71＞云煙87＞RY21＞云煙105＞渠首1號(hào)；96 h時(shí)渠首1號(hào)、RY21和NC71綠原酸含量較高，云煙105和云煙87綠原酸含量較低。

2.2.3 煙葉蕓香苷的方差分析及含量變化 由表3可知，煙葉蕓香苷含量在不同品種、成熟度及其互作間差異均達(dá)到1%顯著水平。其中成熟度對(duì)煙葉初烤時(shí)蕓香苷的積累影響最大，24～96 h間以品種影響作用最大。

圖6 不同烤煙品種烘烤過(guò)程中綠原酸含量變化

由圖7可知，蕓香苷含量在烘烤期間的變化規(guī)律與綠原酸一致。烘烤前中期（0～48 h）5個(gè)品種蕓香苷含量始終表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟，且不同成熟度間差異顯著；72 h時(shí)不同成熟度的蕓香苷含量有一定程度的下降，降幅為過(guò)熟＞未熟＞適熟；96 h時(shí)蕓香苷含量表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟。

圖7 不同成熟度對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中蕓香苷含量的影響

由圖8可知，不同品種間蕓香苷含量存在差異，表現(xiàn)為：0 h時(shí)，云煙87＞RY21＞渠首1號(hào)＞云煙105＞NC71；24 h時(shí)，云煙87蕓香苷含量最高，其它品種含量差異不顯著；48 h時(shí)，RY21和渠首1號(hào)蕓香苷含量最高，其次為云煙87和NC71，云煙105最低；72 h時(shí)，不同品種的蕓香苷含量有一定程度的下降，表現(xiàn)為云煙87＞RY21＞渠首1號(hào)＞NC71＞云煙105；96 h時(shí)，云煙87蕓香苷含量顯著高于其它品種，其它品種間差異不顯著。

2.2.4 煙葉莨菪亭的方差分析及含量變化 由表3可知，煙葉莨菪亭含量在不同品種、成熟度及其互作間差異均達(dá)到1%顯著水平。其中成熟度作用在烘烤前期（0～24 h）影響較大，之后品種作用則影響較大。

由圖9可知，不同成熟度煙葉在烘烤過(guò)程中莨菪亭含量變化趨勢(shì)一致，0～48 h間上升，72 h時(shí)下降到最低值，之后快速上升。烘烤前中期，不同成熟度處理間莨菪亭含量差異顯著，都表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟；72 h時(shí)不同成熟度煙葉莨菪亭含量下降到最低值，降幅表現(xiàn)為未熟＞過(guò)熟＞適熟；96 h時(shí)適熟煙葉莨菪亭含量最高，未熟略高于過(guò)熟煙葉。

圖8 不同烤煙品種烘烤過(guò)程中蕓香苷含量變化

圖9 不同成熟度對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中莨菪亭含量的影響

圖10 不同烤煙品種烘烤過(guò)程中莨菪亭含量變化

由圖10可知，不同品種間莨菪亭含量存在差異，表現(xiàn)為：0 h時(shí)，渠首1號(hào)含量最高，云煙87、RY21和NC71含量較低，且差異不顯著，云煙105含量最低；48h時(shí)，云煙105莨菪亭含量最高，其它4個(gè)品種差異不顯著；72 h時(shí)，各品種莨菪亭含量下降到最低值，表現(xiàn)為云煙87＞云煙105＞渠首1號(hào)＞RY21＞NC71；96 h時(shí)，云煙105、RY21、NC71和渠首1號(hào)莨菪亭含量較高，且差異不顯著，但顯著高于云煙87。

3 討論

采收成熟度對(duì)烤煙烘烤過(guò)程中PPO活性和多酚類(lèi)物質(zhì)含量有重要影響。調(diào)制過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)的變化主要是由PPO作用下進(jìn)行的酶促棕色化反應(yīng)的結(jié)果［13］。烘烤階段的變黃末期至定色初期，為棕色化反應(yīng)敏感期。此時(shí)隨著溫度的升高和水分的散失，葉細(xì)胞趨于死亡，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得多酚和PPO接觸，且氧氣大量進(jìn)入，生成醌類(lèi)物質(zhì)，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)［14］。

PPO在煙草中是一種重要酶類(lèi)，主要存在于葉綠體中［15］。調(diào)制過(guò)程中其活性與多酚類(lèi)物質(zhì)含量密切相關(guān)［16］。岳誠(chéng)等［17］研究表明，PPO活性在烘烤中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致。宋洋洋等［18］研究表明，變黃末期至定色前期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨著采收成熟度的提高，能夠有效降低PPO活性。武云杰等［19］研究表明，降低烤前和定色期煙葉的PPO活性，可以增加葉片的耐熟度，減少棕色化反應(yīng)的發(fā)生，使煙葉耐烤性增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，烘烤期間各成熟度處理煙葉PPO活性有顯著差異，在棕色化反應(yīng)敏感時(shí)期（48～72 h）PPO活性始終表現(xiàn)為未熟＞適熟＞過(guò)熟。PPO活性隨著成熟度的升高而降低很可能是由于過(guò)熟煙葉水分含量較低，隨著溫度的升高，煙葉細(xì)胞裂解較快，細(xì)胞完整性被破壞，PPO所處環(huán)境的水分含量升高而導(dǎo)致［20］。

煙草中多酚類(lèi)物質(zhì)受品種類(lèi)型、部位、煙葉成熟度的影響［21］。多酚類(lèi)物質(zhì)在煙葉中全部以葡萄糖苷和酯的形式存在，其中綠原酸、蕓香苷、莨菪亭是最主要的成分［22］。烤煙在烘烤期間酚類(lèi)物質(zhì)的變化十分劇烈，煙葉中的多酚糖苷和酯類(lèi)等在水解酶作用下生成大量的多酚和糖朊，酚類(lèi)物質(zhì)總量明顯增加［23］。宮長(zhǎng)榮等［24］研究表明，烘烤后的前24 h多酚含量呈增加趨勢(shì)。樊寧［25］通過(guò)對(duì)烘烤過(guò)程中綠原酸和蕓香苷的測(cè)定結(jié)果表明，烘烤定色期間二者含量比較穩(wěn)定，甚至表現(xiàn)為減少趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，初烤和烤后的多酚含量表現(xiàn)為適熟＞過(guò)熟＞未熟，說(shuō)明成熟度高的煙葉烤前多酚含量高，烤后多酚含量也高。多酚含量高說(shuō)明其不易發(fā)生棕色化反應(yīng)，減少了雜色煙［26］。多酚類(lèi)物質(zhì)含量隨著PPO活性的增加，其含量開(kāi)始下降。而過(guò)熟煙葉由于細(xì)胞間隙增大，組織疏松，一部分多酚會(huì)被活性氧氧化［27］，因此多酚類(lèi)物質(zhì)以適熟煙葉的含量最高。

PPO活性和多酚類(lèi)物質(zhì)含量除隨成熟度變化，還與品種特性相關(guān)。多酚類(lèi)物質(zhì)含量和組分具有定量遺傳特性，應(yīng)當(dāng)選擇適宜的生育期及品種［28］。品種對(duì)PPO活性和多酚類(lèi)物質(zhì)含量有顯著性影響。在棕色化反應(yīng)敏感時(shí)期，對(duì)于PPO活性較高的品種，可提高采收成熟度促進(jìn)多酚類(lèi)物質(zhì)含量的增加。劉化冰等［29］研究表明，豫煙11號(hào)和K326以成熟采收、云煙87以過(guò)熟采收多酚類(lèi)物質(zhì)含量高。本研究結(jié)果表明，云煙87的PPO活性較低，適熟采收多酚物質(zhì)含量高。其不一致的原因很可能是因?yàn)槎喾宇?lèi)物質(zhì)含量除受成熟度的影響外，還受生態(tài)、海拔、栽培措施等影響［30-32］。

4 結(jié)論

多酚類(lèi)物質(zhì)的積累與PPO活性和煙葉的成熟度密切相關(guān)。5個(gè)品種在烘烤過(guò)程中該類(lèi)物質(zhì)的積累趨勢(shì)一致，但在量的積累上有一定差距。PPO活性和多酚類(lèi)物質(zhì)含量受成熟度影響較大，其次是品種。適熟煙葉與其它成熟度煙葉相比，其多酚類(lèi)物質(zhì)含量的積累更好，過(guò)熟煙葉相似或略低于適熟煙葉，未熟煙葉積累最少。適熟采收可以降低PPO活性，提高多酚類(lèi)物質(zhì)的積累。