‘中煙100’根系響應鐮刀菌侵染的轉錄組數據分析及生理生化變化研究

趙鳳霞，米琳，丁燕芳，宋學立，何嘉，孫小瑞，徐沛瑤，王海濤

（河南省農業科學院煙草研究所，河南 許昌 461000）

煙草是我國重要的經濟作物，也是一種重要的模式植物，在基礎研究和應用研究方面發揮了巨大作用。煙草病害一直是嚴重制約世界煙草生產和科研發展的重要難題，其中煙草鐮刀菌根腐病是近年來危害煙草行業的最重要病害之一［1，2］，在河南、山東、云南、貴州等地均有發生，發病范圍和程度有逐年加重的趨勢，部分省市重病煙田發病率達30%以上［2，3］。2013年河南省平頂山煙區發病率高達5%～10%，造成3 000萬元左右的經濟損失。本課題組對烤煙根腐病的分離和鑒定以及河南省主栽烤煙品種抗病性進行了大量研究，認為引起河南省煙草鐮刀菌根腐病的優勢致病菌為尖孢鐮刀菌，約占總致病菌的81.25%［4，5］。

目前根腐病的防治主要采用抗病育種和生物防治的方法，但具體操作具有一定局限性，由于缺乏特效藥劑和抗性品種，煙草根腐病的治理難度相當大，危害極其嚴重［6］。只有充分認識病原菌的致病機制，才能找到最經濟、有效、環保的防治方法，降低根腐病的危害程度。目前對煙草抗病機理的研究主要集中在抗病基因定位和分子標記輔助育種［7］、基因組學和抗性基因的轉化等方面［8］，而通過轉錄組學方法結合抗病相關生理生化指標的檢測，對烤煙抗病性開展的研究較少。

轉錄組學為抗病性研究提供了同步進行多處理、多組織比較的平臺，研究植物在病原菌侵染條件下多重應對通路的串擾，有利于全面了解植物針對病原菌侵染的應對網絡［9］。目前，轉錄組測序技術已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。王元英［10］對普通煙草種紅花大金元及野生種林煙草、絨毛狀煙草、耳狀煙草開花時期的主要器官（根、莖、葉和花）進行了轉錄組測序與分析，對比絨毛狀煙草全基因組，并根據絨毛狀煙草基因組抗病相關R基因的生物信息分析結果，選取其中的重要基因批量設計引物，構建了高通量的煙草RNAi載體庫，為進一步開展煙草抗病相關R基因的克隆及其功能的鑒定驗證奠定了基礎。Ferrario-Méry等［11］研究了煙草中碳氮的代謝途徑，整合了該代謝途徑中轉錄組、酶活性及代謝組學的相互關系，分析了谷氨酰胺合成酶在氮代謝過程中的作用。

研究鐮刀菌根腐病侵染后烤煙根系基因表達以及抗病相關酶類活性和物質含量的差異，結合內源激素含量差異分析，有助于深入研究烤煙抗病機理，為烤煙根腐病的預測預警提供數據支撐和根腐病的有效防治和培育高抗品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為河南省主栽品種‘中煙100’。選取大田生長條件下感病煙株（記作T），經鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）致病株，以同地塊未侵染的正常生長煙株作為對照（記作CK）。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 轉錄組學研究方法 提取樣本RNA，檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫。庫檢合格后，用HiSeq 2500進行高通量測序，測序讀長為PE100。對Raw Data進行數據過濾，去除其中的接頭序列及低質量Reads獲得高質量的Clean Data，將Clean Data進行序列組裝，獲得該物種的Unigene庫。采用Trinity軟件進行組裝，使用BLAST［12］軟件將Unigene 序 列 與 NR［13］、Swiss-Prot［14］、GO［15］、COG［16］、KOG［17］、KEGG［18］數據庫比對，預測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER［19］軟件與Pfam［20］數據庫比對，獲得Unigene的注釋信息。

1.2.2 根系外觀形態檢測 使用EPSON LA2400掃描儀觀察根系形態差異，利用WinRHTZO根系分析系統進行圖像分析。

1.2.3 酶類活性等生理指標測定 參考前人的檢測方法［21］：超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用比色法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）、多酚氧化酶（PPO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）活性、總抗氧化能力（T-AOC）和超氧陰離子清除率采用酶標儀法；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定采用紫外分光光度法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創木酚比色法；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用2-VP法測定；脯氨酸（PRO）含量采用可見分光光度法測定；丙二醛（MDA）含量的測定采用2-硫代巴比妥酸顯色法。

1.2.4 內源激素含量測定 采用HPLC法進行測定：稱取0.1 g樣本，放入研缽中磨碎，加入1mL預冷的試劑一，4℃浸提過夜。8 000×g離心10 min，殘渣用0.5 mL試劑一浸提2 h，離心后取上清液，合并兩次上清液，40℃減壓蒸發至不含有機相（約剩0.5 mL水溶液），加入0.5 mL試劑二萃取脫色3次，棄去上層醚相，下層40℃減壓蒸干，加入0.5 mL試劑三溶解，針頭式過濾器過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測。

HPLC液相條件：Rigol L3000高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）。流動相的配制：取200 mL甲醇和300 mL超純水混合，加入3 mL試劑四，混勻。進樣量10μL，流速0.8 mL／min，柱溫35℃，走樣時間40 min，檢測波長254 nm。用流動相過柱子，待基線穩定后加樣。

1.3 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17對數據進行處理、統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 轉錄組學分析

通過RNA-seq技術，對病原菌侵染的‘中煙100’和對照根系的轉錄組進行了測序，共獲得30.71 Gb Clean Data，通過Trinity組裝，共得到907 812條Transcript和686 933條Unigene（表1）。

表1 組裝結果統計表

將獲得的Unigene序列與COG、KEGG等數據庫比對，預測完Unigene的氨基酸序列之后與Pfam數據庫比對，獲得Unigene的注釋信息。通過選擇BLAST參數E-value不大于10-5和HMMER參數E-value不大于10-10，最終獲得373 204個有注釋信息的Unigene，基因注釋的統計結果如表2所示。

表2 Unigene注釋統計

采用DESeq進行樣品組間的差異表達分析，獲得差異表達基因集。通過NR庫對Unigene進行基因注釋，對所有的Unigene進行物種分類，將屬于煙草的Unigene序列單獨列出，進行差異基因表達分析，差異表達基因數如表3所示。

表3 煙草中差異表達基因數

對差異表達基因進行模式聚類、功能注釋以及富集性分析，結果顯示差異基因的功能主要涉及不同生物學過程、細胞組分和分子功能等幾個方面。將Unigene與COG數據庫進行比對，結果顯示一般功能性基因的Unigene最多，其次為轉錄翻譯、核糖體結構和生物學功能相關的Unigene，差異基因主要涉及核糖體的結構成分、序列特異性DNA結合轉錄活性因子、序列特異性DNA結合、ATP結合、過氧化還原酶活性、纖維素合酶（形成UDP）活性、rRNA結合等方面。對差異表達基因KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類，其中新陳代謝相關的Unigene占比最高；遺傳信息傳遞相關的差異表達基因中以蛋白質加工相關基因含量最高；代謝過程的差異表達基因以淀粉和蔗糖代謝相關的基因含量最高；信號傳導過程相關的差異表達基因以植物激素信號轉導相關基因含量最高；另外，植物病原體互作相關基因所占比例也較高。

2.2 侵染煙株形態

病原菌侵染前后，整個煙株及根系外觀形態差異顯著。與正常煙株相比，發病煙株矮小，葉片發黃枯萎；主根和側根數量顯著減少，呈腐漬狀且變黑腐爛（圖1）。

圖1 病原菌侵染后煙株及根系形態

由表4可知，病原菌侵染后煙株根系長度、截面積、表面積、根系體積均顯著低于對照株；侵染煙株平均直徑為0.78 mm，顯著高于對照株的0.47 mm。

表4 發病煙株根系形態指標

2.3 內源激素含量測定

與大田正常生長煙株相比，病原菌侵染后煙株根系和葉片吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、細胞分裂素（ZA）和脫落酸（ABA）含量均顯著升高（圖2）。病原菌侵染后烤煙根系IAA含量為對照的3.25倍，葉片IAA含量為對照的1.58倍；烤煙根系GA3含量為對照的5.68倍，葉片GA3含量為對照的1.65倍；烤煙根系ZA含量為對照的1.58倍，葉片ZA含量為對照的1.37倍；烤煙根系ABA含量為對照的1.57倍，葉片ABA含量為對照的2.45倍。

2.4 酶類活性及保護性物質含量變化

2.4.1 抗氧化相關酶類活性變化 如圖3所示，病原菌侵染后烤煙根系SOD活性為14.73 U／mg prot，顯著高于對照（11.81 U／mg prot）；CAT活性為8.46 U／mg prot，極顯著高于對照（1.16 U／mg prot）；APX活性為0.015μmol／（min·mg prot），顯著低于對照［0.032μmol／（min·mg prot）］。

2.4.2 酚類化合物次生代謝相關酶類活性變化病原菌侵染后烤煙根系PAL、POD和PPO活性變化如圖4所示。侵染后根系PAL活性為3.91 U／mg prot，POD活性為4.28 U／mg prot，PPO活性為2.42 U／mg prot，均顯著高于對照。

圖2 病原菌侵染后烤煙根系和葉片內源激素含量

圖3 病原菌侵染后烤煙根系抗氧化酶類活性

圖4 酚類化合物次生代謝相關酶類活性

2.4.3 谷胱甘肽氧化還原反應相關酶類活性和物質含量 與谷胱甘肽氧化還原反應相關的酶類包括GSH-Px和GST。病原菌侵染后烤煙根系GSH-Px活性為313.91 nmol／（min·mg prot），極顯著高于對照［90.48 nmol／（min·mg prot）］；GST活性為1.46 nmol／（min·mg prot），顯著高于對照［0.43 nmol／（min·mg prot）］；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量為0.25 nmol／mg prot，極顯著高于對照（0.03 nmol／mg prot）（圖5）。

圖5 谷胱甘肽氧化還原反應相關酶類活性和物質含量

2.4.4 其它指標含量變化 本研究檢測了鐮刀菌根腐病侵染后烤煙根系T-AOC、超氧陰離子清除能力、MDA以及PRO含量變化。結果（圖6）顯示，病原菌侵染后根系總抗氧化能力約為對照的12倍，超氧陰離子清除率、MDA和PRO含量均顯著升高。

圖6 烤煙根系T-AOC、MDA、PRO含量及超氧陰離子清除率等指標變化

3 討論

病原菌侵染導致烤煙根系抗病相關基因表達量升高，根系和葉片內源激素含量發生顯著變化，與轉錄組學研究中對差異表達基因的KEGG注釋結果一致，即信號傳導過程相關的差異表達基因以植物激素信號轉導相關基因含量最高，另外，代謝相關基因和植物病原體互作相關基因所占比例也較高。

正常生長的植物體內，抗氧化酶類和非酶類活性氧清除系統可以清除植物體內產生的活性氧自由基，自由基的產生和清除系統是平衡的，植物不會受到傷害。在病原-寄主互作過程中，活性氧作為植物細胞的信號傳導分子，在病原菌入侵后迸發［22］，誘導抗氧化系統活性增強，從而引起植物對脅迫的響應。鐮刀菌根腐病侵染煙株后，根系活性氧自由基大量產生，從而誘導了SOD、CAT等抗氧化酶類活性增強，與前人研究結果一致［23，24］。抗氧化酶類活性的增強是煙株對病原菌入侵的早期防衛反應，對于提高煙株自身抗病性具有重要意義。APX是植物體內清除H2O2的一種重要抗氧化酶類，煙株被鐮刀菌根腐病病原菌侵染后根系APX活性與對照相比顯著降低，與前述SOD和CAT等抗氧化酶類活性的變化趨勢并不相同，可能原因在于H2O2誘導了煙株根系的程序性細胞壞死反應，防止病原菌進一步侵染，而APX活性降低，可以防止H2O2的降解，該變化趨勢與Mittler等［25］對于煙株感染煙草花葉病毒的研究結果一致。

植物與病原菌互作過程中會發生代謝變化，而酚類化合物次生代謝是最為顯著的變化之一，PAL、POD和PPO與酚類化合物的合成和氧化密切相關，對植物抗病性發揮重要作用。PAL是植物體苯丙烷類物質代謝的限速酶，是進行抗、感品種比較和證明抗病因子作用的重要指標之一。前人研究表明病原菌的侵染和病原菌毒素處理都能誘導苯丙氨酸解氨酶活性增強，且酶活增強與抗病性正相關［26］。本研究煙株根系被病原菌侵染后PAL活性顯著高于對照，與前人在甘蔗等研究中的結果一致［27］。PAL活性升高可以促進苯丙烷類物質代謝，產生更多的代謝物，阻擋病原菌的入侵，從而降低病原菌造成的危害。POD可以催化H2O2或者氫過氧化物類似物反應，清除活性氧自由基，同時它還參與植物酚類的聚合和氧化，以及木質素和植保素的合成代謝，在植物抗病性中發揮重要作用。本研究中病原菌侵染后烤煙根系POD活性顯著高于對照。PPO催化木質素和其他酚類氧化物的形成從而抵抗病原菌入侵，也與植物抗病性密切相關［28，29］，本研究中烤煙感病后根系PPO活性明顯升高，約為對照的2倍。

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一，能夠特異地催化GSH與活性氧反應，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而保護生物膜免受活性氧的損害，維持細胞的正常功能；GST具有GSH-Px活性，可以修復氧化破壞的DNA、蛋白質等大分子。本研究結果顯示，病原菌侵染后GSH-Px和GST活性均顯著升高。

在植物代謝過程中會產生超氧陰離子自由基，它可攻擊生物大分子，如脂質、蛋白質、核酸和聚不飽和脂肪酸等，引起細胞結構和功能的破壞，超氧陰離子清除能力與機體衰老和病變有很密切的關系。本研究病原菌侵染后超氧陰離子清除能力顯著上升，約為對照根系的2倍。T-AOC是各種大小分子抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，體現了該體系的抗氧化能力總和，病原菌侵染后T-AOC含量極顯著升高，約為對照的12倍。

PRO也與植物抗逆性密切相關，前人對于干旱和低溫等非生物脅迫的研究表明，逆境條件下煙草游離PRO含量有所增加，可以增強其抗逆性［30，31］。本研究結果顯示，病原菌侵染后烤煙根系游離PRO含量為對照根系的3倍，極顯著高于對照。活性氧的大量產生如果超出了植物清除活性氧的能力，會造成氧化脅迫，進而造成蛋白質、膜脂、DNA及其他細胞組分受到損傷，造成氧化損傷。MDA是膜脂過氧化的產物之一，通過與細胞中多種成分發生化學反應，引起寄主防御反應的發生［32］，其含量的多少直接體現了活性氧對膜脂的毒害和損傷程度［33，34］。本研究病原菌侵染后的烤煙根系MDA含量顯著高于對照，表明病原菌對根系的細胞結構和功能造成了嚴重破壞，活性氧造成的損害較為嚴重，與梁鄲娜等［32］在黃瓜、黃偉等［35］在苜蓿上的研究結果一致。

4 結論

烤煙根系被病原菌侵染后，基因表達發生變化，抗病相關基因、代謝以及內源激素合成相關基因表達量上升。同時根系發生了顯著的生理生化變化，為了能夠保持正常生長發育，激發了體內的一系列防御性酶類發揮作用，如SOD、POD、CAT、PPO、PAL等，同時PRO和MDA含量增加，抗氧化物質和滲透調節等物質含量的上升都在烤煙抵御病原菌侵染的過程中發揮著重要的保護和修復作用，這些酶類和物質的活性變化有效抑制了活性氧自由基的產生，并提高了植物對病原菌脅迫的抵抗能力。