海藻多糖對子宮內膜癥大鼠炎癥反應和氧化應激的影響

史 琳 焦緒棟 王程軍

1 濱州醫學院藥學院 山東 煙臺 264003；2 金鑼醫院 山東 臨沂 276036；3 中國科學院煙臺海岸帶研究所 山東 煙臺 264000

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)為常見慢性婦科疾病之一，也是不孕不育的主要原因之一，多造成卵巢囊腫[1]。EMS的主要臨床癥狀為慢性非月經疼痛、急性骨盆疼痛、呼吸困難、陰道出血等[2]。EMS的發病機制尚不完全明確，目前認為是由環境因素或營養不良造成的一種自身免疫性疾病或激素性疾病[3]。子宮內膜受到多種內分泌激素調節，主要包括雌激素和黃體酮，激素分泌失衡參與子宮內膜癥的發生和發展[4]。促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)共同調節卵泡激素的分泌。EMS患者性腺軸功能異常，對激素的敏感性明顯減低。EMS患者的氧化和抗氧化系統的失衡在其發病過程中起到決定性作用，另外，局部盆腔炎癥反應失衡，造成炎癥因子大量積累也是發病機制之一[5-6]。EMS患者外周血中氧化應激標志物明顯增加，如熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和脂質過氧化氫物等[7]，其中MDA增加顯著，在EMS的診斷中具有重要意義[8]。EMS患者腹腔內多種炎癥因子分泌增加，如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等，從而增加血管的通透性和組織粘連[9-10]。因此，重塑炎癥反應和氧化反應平衡是改善EMS癥狀的關鍵。臨床上多以藥物和手術治療EMS為主，但是存在對機體損傷大、懷孕率低、復發率高等缺陷，因此尋找簡便、快捷、不易復發的新型治療手段迫在眉睫。

海藻多糖是天然的活性物質，具有廣泛的生物學活性和藥用價值。近年來，海藻多糖的藥理學被廣泛研究，如抗病毒[11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13]和降血脂[14]等。海藻多糖可以顯著抑制潰瘍性結腸炎小鼠IL-6炎癥因子的分泌[15]。海藻具有軟堅散結的功效，是中醫治療EMS的常見用藥。海藻多糖作為海藻的主要活性成分其對EMS保護作用尚未見報道。本研究通過制作大鼠EMS疾病模型，應用現代分子生物學技術評估海藻多糖對EMS的治療程度，為開發新型的治療EMS的藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠，體質量為200～220 g，清潔級，由北京華阜康有限公司動物研究中心提供。

1.2 主要試劑 海藻多糖(Sigma公司)，青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)，Rat-FSH Elisa試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)，Rat-LH和Rat-IL-6 Elisa試劑盒(美國R&D公司)，MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器 電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，微量移液器和酶標儀(Thermo公司)，石蠟切片機(Leica公司)，和普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS CX3公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及模型的建立 30只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組和海藻多糖高、中、低劑量組共5組，每組各6只。參照Jones[16]的造模方法，購買大鼠后喂養1周開始造模，稱量大鼠體質量，腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，給藥劑量為0.3 mL/kg，等大鼠完全麻醉后，用橡皮筋把大鼠固定到鼠板上，并用棉簽蘸取碘伏對腹部進行消毒處理，用鑷子提起腹壁，用剪刀沿腹中線輕輕剪開腹壁，用棉簽把腸道取出，放到無菌紗布上，尋找到左側子宮角后，用結扎線結扎，并用剪刀取部分子宮組織。然后迅速把組織放入裝有無菌PBS的培養皿中，用鑷子去除脂肪后，把內膜剪成方形的小方塊，大小約為0.5 cm×0.5 cm，用縫合針把剪好的方形內膜與腹壁一起縫合好，再把腹壁縫合好。手術后4周，再次麻醉大鼠，開腹觀察。子宮內膜體積變大到約30 mm3以上，且有血管形成和水腫等病變，可以認定造模成功。造模成功后，開始灌胃給藥，低劑量組為150 mg/kg，中劑量組為300 mg/kg，高劑量組為600 mg/kg，空白組和模型組給予等體積的溶劑, 每天給藥1次，連續給藥兩周后取材。

1.4.2 組織形態學觀察 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，取各組大鼠異位內膜組織，用4%的多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋、切片和HE染色后, 光學顯微鏡觀察各組異位內膜組織病理學變化。

1.4.3 血清FSH、LH、MDA和IL-6水平的檢測 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，腹主動脈采血，3 000 rpm離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒的操作說明檢測各組FSH、LH和IL-6的變化，同時檢測各組MDA積累。

2 結果

2.1 HE染色觀察內膜病理變化 HE染色后用顯微鏡拍照并觀察各組病理變化，見圖1。對照組內膜上皮呈高柱狀或柱狀整齊排列，界限清晰，細胞核大小適中，形態規則，可見核下空泡，間質細胞排列均勻。模型組腺體形態發生明顯改變，內膜上皮呈現矮柱狀，細胞核變大，細胞包漿內容物增多，細胞間質增多，細胞間隙變小，內膜增厚。海藻多糖各治療組異位內膜均受到不同程度的抑制。低劑量組內膜組織萎縮變薄，細胞呈矮柱狀，排列松散；中劑量組腺體數目減少，腺腔萎縮，功能層變薄；高劑量組部分大鼠異位內膜完全消失，呈劑量依賴性。

圖1 各組大鼠異位子宮內膜的病理變化(HE染色，×400)

2.2 海藻多糖對外周血中LH水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠外周血中LH激素的水平升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中LH水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組LH水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖2。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖2 海藻多糖對外周血中LH水平的影響

2.3 海藻多糖對外周血FSH水平變化的影響 FSH水平也是反映EMS造模是否成功的常用指標。同LH一樣，模型組大鼠外周血中FSH激素的水平與對照組相比也升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中FSH水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組FSH水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖3。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖3 海藻多糖對外周血FSH水平的影響

2.4 海藻多糖對外周血中IL-6分泌的影響 模型組大鼠外周血中IL-6的水平與對照組比較升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中IL-6的水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組IL-6與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖4。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖4 海藻多糖對外周血中IL-6分泌的影響

2.5 海藻多糖對外周血中MDA水平的影響 MDA是脂質分子過氧化的產物，檢測各組血清中MDA的水平變化可以反映海藻多糖對氧化應激的影響。模型組大鼠外周血中MDA的水平與對照組比較升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中MDA水平，呈劑量依賴性, 中劑量組、低劑量組和高劑量組MDA水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖5。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖5 海藻多糖對外周血中MDA水平的影響

3 討論

EMS是育齡婦女的常見病，發病率高達10%～15%，由于EMS的發病機制不明確，治療方法需不斷完善。目前EMS的治療方法主要包括手術治療和藥物治療，但是效果不理想，無論是藥物還是保守性手術均有相當高的復發率。海藻多糖具有多種抗炎和抗氧化作用，可以抑制炎癥反應和氧化損傷來減輕關節炎過度損傷[18]。

本研究發現不同劑量海藻多糖對EMS均具有不同程度的改善作用，其機制主要通過抑制癥因子的分泌和過氧化物的積累發揮作用。EMS是激素依賴性疾病，體內雌激素水平平衡失控促進了EMS的發生和發展[17]，體內FSH和LH的水平升高，并作用于卵巢促進雌激素的分泌[18]。本研究表明，海藻多糖對EMS大鼠高水平的FSH和LH均有抑制作用，高劑量組使其趨于正常水平，調節激素內分泌系統的紊亂可能是其治療EMS的作用機理之一。

在EMS患者腹腔液中，腹腔巨噬細胞活化分泌大量炎癥因子，從而抑制巨噬細胞的吞噬[19]。本研究表明，海藻多糖抑制EMS大鼠血中IL-6的分泌，使其趨于正常水平，其抗炎作用可能是其治療EMS的作用機理之一。本研究檢測了外周血中MDA水平，發現海藻多糖可以抑制EMS大鼠血清中MDA的積累，使其趨于正常水平，其抗氧化作用可能也是其治療EMS的另一作用機制。

綜上所述，海藻多糖可以抑制卵巢部位異位內膜的生長，降低外周血中激素水平，調節機體免疫失調和氧化還原失衡。提示海藻多糖確實對EMS大鼠的病情發展有確切的療效，值得進行下一步臨床研究。