光照脅迫對珠子參生長和皂苷類活性成分積累及同工酶影響

李 慧，鄒晨鑫，李 鉑，姜 祎，高 靜，顏永剛，張 崗，宋小妹，楊新杰

(陜西中醫藥大學 藥學院/陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心，陜西 咸陽 712046)

珠子參PanacisMajorisRhizoma(PMR)系五加科植物珠子參[PanaxjaponicusC. A. Mey. var. major (Burk.) C. Y. Wu et Feng ex C. C how]的干燥根莖，主要分布于我國陜西、四川、云南、甘肅、貴州等地。味苦、甘，性微寒，具有補肺養陰，祛瘀止痛，止血的功效，主治氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關節痹痛、咳血、吐血、崩漏、外傷出血等[1]。藥用歷史悠久，為太白七藥之一。現代化學研究表明珠子參主要含有皂苷、多糖、揮發油和多種微量元素等成分，其特征性成分主要包括竹節參皂苷Ⅳa、人參皂苷Ro、Rc、Re、Rf、三七皂苷R2、珠子參皂苷R1等三萜皂苷類化合物[2]。藥理研究表明珠子參有鎮痛鎮靜[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、增強免疫功能[6]以及促進骨髓造血功能[6]等藥理活性。

光是植物生存和生長發育不可或缺的條件之一，它調控著植物次生代謝產物的合成和積累。眾多相關研究報道表明，光對藥材的生長及其有效成分的積累有顯著影響，可以通過調控光照條件的手段來提高藥材產量及有效成分含量。同工酶為催化反應相同而結構及理化性質不同的酶的分子類型，是生物機體中的天然標記，可反映出機體里的各種變化，在植物生長發育過程中普遍存在同工酶的階段特異性，其酶譜表現與生長發育階段密切相關，且不同同工酶種類其特異性不同[7]，可作為研究生理和代謝產物變化的指標。珠子參生長緩慢，成藥周期較長，多生于蔭蔽濕潤的環境[8]，可見其對光照溫度有一定的要求，關于不同光照條件對珠子參皂苷類次生代謝產物積累及同工酶表達筆者還未見研究，因此用光照調控試驗，以揭示珠子參中不同同工酶與次生代謝產物積累的相關性，掌握珠子參的生長發育規律，探討不同光照對珠子參生長以及皂苷類次生代謝產物積累的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

珠子參材料來自陜西太白山珠子參種植基地，由陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為五加科植物珠子參[PanaxjaponicusC. A. Meg var. major (Burk.) C. Y. Wu et Feng]的幼苗。對照品人參皂苷Ro(批號 111903-201805)和人參皂苷Rg1(批號110703-201933)均購于中國食品藥品檢定研究院，竹節參皂苷Ⅳa(批號B21676)購于上海源葉公司。丙烯酰胺(天津天力化學試劑有限公司)、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨均為(天津科密歐化學試劑有限公司)、Tris(北京博奧拓達科技有限公司)、溴酚藍(上海季藍生物有限公司)，TEMED(德國sigma公司)，水為去離子水。有機質購買德國大漢植物營養泥炭土栽培介質，內含全氮4.4%、有機質94.3%、PH值5.6、水分38.1%、電導度值0.2 dS/m。

1.2 儀器

MGC-300H 人工氣候箱(上海一恒科學有限公司)，Waters 2695 高效液相色譜儀，BIO-RAD 電泳儀及BIO-RAD mini 垂直電泳槽(美國伯樂公司)，GB204 型電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統有限公司)；KQ-200KED 超聲波清洗機 (江蘇昆山超聲波儀器有限公司)；GZX- 9140MBE電熱鼓風干燥箱 (上海博迅醫療設備有限公司)。

2 方 法

2.1 珠子參幼苗培養與處理

將珠子參幼苗移栽于花盆內，內置栽培基質，用自來水充分浸潤后置于溫室大棚同等條件下培養14 d后選取長勢一致的健康幼苗300株供試驗所用，供試材料放置人工氣候培養箱內適應一周后開始光照處理。在溫度25℃，濕度為70%，光周期12 h/12 h下，設置3個試驗組(氣候箱光照范圍0～20 000 lx)，分別為強光組16 000 lx、對照組8 000 lx(飽和光)、弱光組4 000 lx，每組100株珠子參幼苗，連續處理27 d。分別于第1、3、5、8、13、21、27 d上午9時隨機取樣10株作為待測樣品，共取7次，去除泥沙洗凈濾紙吸干水分，一部分存放于-80℃冰箱保存用于同工酶測定，另一部分于50℃烘干，用于有效成分含量的測定，每組處理三次重復。

2.2 生長指標的測定

分別于第1、3、5、8、13、21、27 d隨機選取10株珠子參，測定珠子參生物量(干重)。

2.3 皂苷類成分HPLC分析

HPLC測定分析參考文[9]的方法優化。珠子參根莖烘干，稱重，粉碎，取0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重。超聲處理40 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放至室溫，補足失量，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測。精密稱取各對照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用適量色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含人參皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人參皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹節參皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1的對照品儲備液，進0.22 μm微孔濾膜濾過即。得色譜條件為：色譜柱為Thermo C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.02%磷酸水(B)，梯度洗脫：0～10 min(5%～40% A)；10～22 min(40%～75% A)；22～34 min(75%～90% A)，檢測波長203 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

圖1 供試品溶液(A)和混合對照品(B)的HPLC色譜圖Fig. 1 Sample (A) and HPLC of mixed reference substances(B)注: 1-人參皂苷Rg1；2-人參皂苷Ro；3-竹節參皂苷Ⅳa

2.4 CAT、SOD、POD同工酶譜分析

同工酶主要測量CAT、SOD、POD抗氧化酶活性。方法參考文獻[10-12]加以改進。CAT同工酶用鐵染色法，SOD同工酶用氮藍四唑法，POD同工酶用聯苯胺法。取0.1 g根莖，液氮研磨，加入10 mmol/L Tris-HCl PH 7.4緩沖液，料液比1∶10，浸提24 h，10000 rpm離心10 min，取上清液，加入等量40%蔗糖溶液于-20℃冰箱保存備用，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直版電泳系統分析。SOD和POD采用濃度為10%分離膠，CAT為7.5%分離膠，濃縮膠均為3%的分離度，Tris-Gly(PH 8.3)作為電泳緩沖液，上樣量為20 μl，電泳在冰上進行，濃縮膠電流15 mA，溴酚藍指示劑通過分離膠改為20 mA，電泳至含40%蔗糖溶液的溴酚藍指示劑遷移至距膠板1 cm時停止電泳。采用Quantity One軟件(版本4.6.9)計算凝膠中譜帶，根據CAT、SOD、POD同工酶譜帶推斷出相應的凝膠背景強度，對圖像定量分析得到的特定的同工酶譜帶進行了簡單的數值表示。

2.5 數據分析

數據處理采用Excel 2010，SPSS 19.0數據統計軟件進行數據分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(Least significant difference,LSD法)進行數據顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 不同光照條件對珠子參生物量(干重)的影響

不同光照條件對珠子參干重的影響見表1，弱光(4 000 lx)下珠子參干重最大，對照組和兩個處理組都在前21 d緩慢增加，在第21 d干重達到最大，第21 d又開始減少，對照組干重均值與弱光組相差無幾，強光組在前期生長速度低于對照組與弱光組，均值也低于強光組，可見強光抑制珠子參生長。

3.2 不同光照處理對珠子參幼苗皂苷類成分積累的影響

不同光照處理對珠子參幼苗中皂苷類成分積累的影響如圖2所示。弱光照處理對人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa的積累起促進作用，而強光照處理抑制其含量增加。不同光照強度處理后，強光組處理第5 d三種皂苷成分含量達到最高值，弱光組、對照組第3 d三種皂苷成分含量達到最高值，后續20多天處于下降模式，含量值有上下波動。不同光照處理的影響依次為4 000 lx>8 000 lx>16 000 lx，3種有效成分含量都呈“M”型或“N”型波動。方差分析表明，珠子參皂苷類成分在各處理下均達到顯著差異水平(P<0.05)。

表1 不同光照條件對珠子參干重的影響Table 1 Effects of different light conditions on the dry weight of PMR(g，n=10)

圖2 不同光照條件下珠子參3種有效成分含量的影響Fig. 2 Effects of different light conditions on the content of three active constituents of PMR

3.3 不同光照處理對珠子參CAT、SOD、POD同工酶的影響

由圖3、4可知在不同光照條件下珠子參CAT、SOD、POD分別有1，2，3條譜帶表達；CAT譜帶都集中在上部，相對遷移率(Relative migration,Rf)約為0.18，酶帶頻率為100%，SOD酶帶都集中在中下部，Rf約為0.6的酶帶出現的頻率最高，Rf 0.53的次之，POD酶譜顯示3條酶帶都集中在上部與下部，Rf值分別為0.01、0.18、0.85。與對照組相比，弱光組珠子參根莖中的CAT活性顯著降低(P<0.05)，SOD活性變化不明顯，POD的活性增強，隨著時間增長，CAT活性變化呈現出先升高后降低的趨勢，SOD活性變化呈現出先降低后升高的趨勢，POD活性變化呈現出逐漸降低的趨勢；強光組珠子參根莖中的CAT活性變化不明顯，SOD活性和POD活性顯著增強(P<0.05)，且隨著時間的增長，CAT活性變化呈現出先升高后降低的趨勢，SOD活性變化呈現出先降低后升高的趨勢，POD活性變化呈現出逐漸上升的趨勢。

圖3 不同光照條件下珠子參同工酶譜圖Fig. 3 Three isozyme profiles of PMR under different light conditions注：1、3、5、8、13、21、27分別代表不同樣品處理時間。

圖4 不同光照處理對珠子參CAT、SOD、POD同工酶的影響Fig. 4 Effects of different light treatments on CAT, SOD and POD isoenzymes of PMR

3.4 珠子參活性成分積累與CAT、SOD、POD同工酶相關性分析

珠子參活性成分積累與生態因子和同工酶表達之間關系密切，存在一定相關性，但許多因素之間的相關性并不明確。為了明確因素之間的相關性以及為了進一步探討不同光照條件下珠子參的調控機制研究，對3種皂苷類有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶進行簡單相關性分析，結果見表2，3，4。

表2 對照組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關性分析Table 2 Correlation analysis of the content of active ingredientsof PMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the control group

表3 強光組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關性分析Table 3 Correlation analysis of the content of active ingredients ofPMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the strong light group

表4 弱光組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關性分析Table 4 Correlation analysis of the content of active ingredientsof PMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the low light group

對照組中SOD與人參皂苷Ro和CAT呈顯著負相關(P<0.05)，強光下有效成分含量與同工酶無顯著性相關，弱光下竹節參皂苷Ⅳa與CAT呈顯著負相關(P<0.05)，從以上結果可知化學成分含量越高與SOD、CAT活性相關性越顯著，其中CAT與有效成分含量較高的人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa最為顯著，這表明在植物受到脅迫時CAT比SOD、POD在促進含量較高的有效成分合成時參與度高。

4 討 論

植物在長期的進化過程中因生長于不同的光照強度下，會形成喜陰或喜陽的特性，對光照強度的響應也會因植物的不同而產生不同結果。珠子參作為秦巴山區特色秦藥之一，隨著市場需求的不斷增加，解決珠子參人工栽培過程中的關鍵技術問題迫在眉睫。人工氣候箱是目前藥用植物受控試驗的常用技術手段之一，能夠最大化確定一個既能促進次生代謝又不影響生物量積累的脅迫閾值、最佳脅迫周期，從而為之后中藥材規范化種植過程中提供參考[13]。通過設置不同的光照強度來闡明不同光照條件對珠子參生長，有效成分以及同工酶的影響。結果表明16 000 lx，4 000 lx，8 000 lx的光照強度對珠子參干重具有不同程度的影響，其中弱光的光照強度下珠子參干重積累最大，強光積累最小，強光組干重均值低于弱光組與對照組，三組前期都緩慢增長在第21 d達到最大后便開始下降，強光組生長最為緩慢，說明過度光強對珠子參產生嚴重迫害，強光抑制珠子參生長。

植物的次生代謝物是長期進化以及由于環境影響而得到產物，它有著提高植物自身保護能力，增強生存競爭能力以及協調與環境關系等方面的重要作用[14]，與初生代謝產物相比在產生和變化方面更易受外界影響。試驗結果表明不同光照條件對珠子參3種有效成分含量積累的影響都具有顯著性影響，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa，3種有效成分在弱光下含量積累最高且差異顯著，強光下有效成分含量積累最低。有學者也發現在溫室中隨著透光率的增加，使人參根中的人參皂苷含量不斷增加，而且人參葉總皂苷中的原人參三醇系皂苷含量高于原人參二醇系人參皂苷含量[15]；植物體內存在不同的同工酶，不同處理過后會產生酶系統的差異。當植物在光飽和點以下時它所需的光能未達到飽和不會對植物造成傷害，當光照過強時會激發活性氧的增加進而破壞植物的抗氧化系統。在本實驗中CAT、SOD、POD均在強光組下條帶表達最強，而珠子參有效成分含量最低，這說明光照強度過大，使得珠子參吸收光能過剩，產生氧自由基，使CAT、SOD、POD活性增高去分解細胞產生的氧自由基，保護細胞防止受到活性氧的傷害。同工酶等的表達調控了珠子參皂苷類活性成分體內合成，而光照條件作為外部因素對皂苷類成分的合成也有著重要的影響，但目前尚未明確皂苷類活性成分代謝途徑究竟如何進行，同工酶的表達相互影響，協同增減，在珠子參根組織中表現出了一定的相關性。通過對珠子參有效成分與同工酶相關性分析發現，強光下有效成分含量與同工酶無顯著性相關，弱光下竹節參皂苷Ⅳa與CAT呈顯著負相關，說明竹節參皂苷Ⅳa與過氧化氫酶存在某種關聯。這可能是不同光照強度使珠子參CAT酶與竹節參皂苷Ⅳa發生反應，推測可能與化合物羥基有關[16]，說明在不同光照條件下CAT同工酶參與調控了皂苷類活性成分的積累。

通過對珠子參不同光照條件脅迫，高效液相色譜法分析其成分變化，同工酶分析酶帶活性，為珠子參后續的質量控制，資源合理利用提供了科學依據。為了進一步闡明珠子參皂苷類次生代謝產物積累的過程，接下來可進一步探討不同光照條件對珠子參根莖中關鍵酶基因表達的影響。