艾灸及艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠肺組織病理及血清IL-4、IFN-γ的影響*

劉津藝 和 蕊 趙百孝

（北京中醫藥大學，北京 102488）

動脈粥樣硬化是指呈黃色粥樣的脂質沉積在血管壁，形成斑塊，導致動脈壁增厚變硬、管腔狹窄甚至閉塞，使重要器官缺血缺氧、功能障礙以至機體死亡，是心肌梗死、腦梗死、下肢缺血的主要病因［1］。經過數十年的探索和研究，因其在病變發生發展過程中始終有各種炎癥細胞和大量炎癥介質參與，目前現代醫學已普遍認為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。大量研究發現，艾灸療法通過其溫熱效應在動脈粥樣硬化過程中可抑制炎癥反應，保護血管內皮功能［2-5］。盡管諸多研究已經證明了艾灸的有效性，但對于在艾灸過程中產生的艾煙的安全性仍存在一定爭議。載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠是近年來動脈粥樣硬化研究的經典動物模型，能夠在自然膳食下形成嚴重的高脂血癥，并自發形成纖維斑塊和復合斑塊，病理學改變與人類極為相似，因此廣泛應用于動脈粥樣硬化的研究中［6］。本實驗通過觀察艾灸及艾煙對ApoE-/-小鼠的一般情況和肺組織病理及血清白細胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）的影響，評價艾灸及艾煙的安全性，并探討艾灸在動脈粥樣硬化炎癥反應過程中的起效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只8周齡采用高脂飼料喂養［北京科澳協力飼料有限公司，飼料配方為78.85%基礎飼料+21%豬油+0.15%膽固醇，許可證號：京飼證（2018）06073］雄性ApoE-/-小鼠作為動脈粥樣硬化模型，10只同周齡相同遺傳背景的雄性非轉基因小鼠C57BL/6作為空白對照。兩種小鼠均購自維通利華（北京）生物技術有限公司，體質量（22±2）g，許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心動物房單籠飼養，均可自由進食飲水，飼養環境溫度為（22±2）℃，濕度為50%～60%左右。采用人工控制室內照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循環。

1.2 試劑儀器 小鼠IL-4酶聯免疫試劑盒（Abbkine公司 KET7007 Lot：ATSJN0601）；小鼠IFN-γ酶聯免疫試劑盒（Abbkine公司 KET7003 Lot：ATSJN0401）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；伊紅染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；特制細艾條（湖北蘄春李時珍醫學集團，規格φ0.8 cm×15 cm）；小鼠固定器（北京冀諾泰有限公司）；光散射式數字粉塵測試儀（北京賓達綠創科技有限公司）；Thermo Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；石蠟切片機（LEICA RM 2235）；石蠟包埋機（LEICA EG 1160）；光學顯微鏡（Nikon E200）。

1.3 分組及處理 30只以高脂飼料喂養的雄性ApoE-/-小鼠［8周齡，體質量（22±2）g］隨機分為模型組、艾灸組、艾煙組（每組10只）。10只以普通飼料喂養的雄性C57BL/6非轉基因小鼠［8周齡，體質量（22±2）g］作為空白對照。空白組及模型組：采用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，每日抓取固定20 min，每周6 d，不予其他處理。

1.4 干預方法 艾灸組采用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，固定器底板處的小孔可暴露胸腹部膻中穴，點燃艾條放置在小鼠胸部膻中穴下方2～3 cm處，每日施灸20 min，每周6 d。艾煙組釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位后，將固定器放入內置有調試好的粉塵測試儀的玻璃缸中。在玻璃缸側方圓孔中插入點燃的艾條，每隔3 min用粉塵測試儀測試其濃度，使玻璃缸中的艾煙濃度控制在5～15 mg/m3之間，每日艾煙干預20 min，每周6 d。

1.5 標本采集與檢測 連續干預14周，末次干預后，禁食不禁水12 h。麻醉小鼠后，每組隨機選取6只采用眼球摘除取血法采集血液約1～1.5 mL，離心后將血清保存于-20℃冰箱中備用。嚴格根據說明書標準程序操作，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清中IL-4、IFN-γ的含量。剩余4只使用PBS緩沖液和4%多聚甲醛進行灌注后，取出肺臟置于4%多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片，HE染色觀察肺臟的病理改變。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。所用數據首先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態性分布且方差齊的計量數據，以（）表示，并采用單因素方差分析法；組間數據有顯著性差異時，再用LSD法進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 實驗干預14周后，未見小鼠死亡，存活率為100%。空白組小鼠外觀體征、行為活動、精神狀態等一般情況正常；模型組小鼠毛色晦暗且有脫落現象，體型肥胖，食欲逐漸下降，精神淡漠、反應遲鈍。艾灸組小鼠毛色暗淡且有脫落現象，食欲、糞便未見異常，行為活動及精神狀態尚可。艾煙組小鼠毛發有脫落現象且顏色暗淡，食欲、糞便未見異常，精神狀態較安靜。

2.2 各組小鼠體質量變化 見表1。實驗開始前，各組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗第4周，模型組小鼠體質量顯著高于空白組（P＜0.05），艾灸組和艾煙組小鼠體質量與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。第8周，空白組與模型組小鼠體質量增長均較快，但模型組體質量仍高于空白組（P＜0.05）。艾灸組和艾煙組小鼠體質量均低于模型組（P＜0.05）。第10周，模型組體質量高于空白組（P＜0.05），艾灸組和艾煙組體質量均低于模型組（P＜0.05）。第12周，模型組體質量仍大于空白組（P＜0.05），與模型組比較，艾灸組和艾煙組體質量較低（P＜0.05）。干預14周后，模型組體重有所降低，但仍高于空白組（P＜0.05），艾灸組與艾煙組體質量仍低于模型組（P＜0.05）。各組小鼠體質量為模型組＞空白組＞艾煙組＞艾灸組，有顯著差異。

表1 各組小鼠體質量比較（g，±s）

表1 各組小鼠體質量比較（g，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組艾灸組艾煙組實驗前23.30±0.37 23.44±0.57 23.53±0.32 23.49±0.45第4周26.09±1.00 27.64±0.74**25.80±1.23△△26.28±0.94△△第8周29.17±1.14 30.90±2.01*26.91±1.84△△28.43±1.28△△第10周30.93±2.01 32.70±1.15*28.82±1.83△△30.42±1.80△△第12周31.41±1.57 34.44±1.23**28.99±1.91△△31.95±1.70△△第14周32.00±1.29 33.64±1.70*29.55±2.05△△31.73±1.83△

2.2 各組小鼠肺組織的病理變化 空白組、模型組、艾灸組和艾煙組肺組織結構完整清晰，可見細支氣管以及終末細支氣管，立方形上皮細胞和扁平上皮細胞覆蓋支氣管管腔。Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細胞結構正常，扁平狀的Ⅰ型肺泡細胞數量較多，立方形的Ⅱ型肺泡細胞數量較少。各組均可見肺泡管、肺泡囊和肺泡，部分細支氣管可見不完整開口，為與肺泡連接處，肺泡為囊泡狀，呈多面體，無結節狀膨大。艾灸組和艾煙組未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織（HE染色，20倍）

2.3 各組小鼠血清IL-4含量比較 見表2。干預14周后，各組小鼠血清中IL-4含量從少到多依次為模型組＜艾灸組＜空白組＜艾煙組。模型組小鼠血清中IL-4含量最低，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；艾灸組和艾煙組小鼠血清中IL-4水平與模型組相比，含量均顯著升高（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組艾灸組艾煙組n 6 6 6 6 IL-4 7.67±0.16 4.59±0.27**6.04±0.27△△8.26±0.75△△IFN-γ 6.95±0.93 13.14±1.32**4.53±0.76△△9.79±1.02△△

2.4 各組小鼠血清IFN-γ含量比較 見表2。干預14周后，各組小鼠血清中IFN-γ的含量從多到少的順序依次為模型組＞艾煙組＞空白組＞艾灸組。模型組小鼠血清中IFN-γ含量最高，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；艾灸組和艾煙組小鼠血清中IFN-γ水平與模型組相比，含量均顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

中醫理論認為，動脈粥樣硬化與“痰濕、氣滯、瘀濁”密切相關，在各種致病因素的綜合影響下，導致痰瘀互結、脈道不利、瘀血內阻，臟腑氣機失調，使得病理產物在脈道內不斷堆積，最終導致動脈粥樣硬化斑塊的形成。艾灸作為傳統中醫中十分重要的一部分，具有溫陽散寒、活血通脈的作用。《景岳全書》云“凡大結大滯者最不易散，必欲散之，非藉火力不能速也，所以極宜用灸”，說明艾灸通過其溫熱效應可以溫通經脈、行氣活血，進而祛除痰濕瘀濁等病理因素，促進病理產物的排出，減緩動脈粥樣硬化的病理演變。但長期以來，艾煙的安全性仍存在爭議，也因此限制了傳統艾灸的推廣和發展。實驗以ApoE-/-小鼠為動物模型，以同周齡相同遺傳背景的非轉基因小鼠C57BL/6作為空白對照，通過觀察各組小鼠的一般情況以及肺組織的病理變化來評價艾灸及艾煙的安全性。小鼠的一般情況主要指生存率、體質量以及行為狀態描述，可直接反映艾灸及艾煙的安全性。通過實驗結果可知，各組小鼠在干預前均無異常，一般情況無差異，但ApoE-/-小鼠在實驗14周后，出現毛色晦暗且有脫落現象，體型肥胖，精神淡漠、食欲下降，反應遲鈍等情況。中醫學認為，動脈粥樣硬化的主要病機在于痰濁壅盛、氣血瘀阻。痰濁壅盛則多見毛發脫落、體型肥胖、精神淡漠，反應遲鈍。氣血瘀阻則見毛色晦暗、食欲下降運化失司等表現。實驗過程中未出現小鼠死亡情況，生存率為100%，說明實驗操作對小鼠的應激作用較小，不影響小鼠的正常生存。實驗前各組小鼠體質量無差異，在前8周各組小鼠體質量均呈現顯著增長趨勢，實驗第8～14周體質量增長趨勢較緩。模型組ApoE-/-小鼠體質量明顯大于空白組C57BL/6小鼠，這一現象與小鼠的基因型和喂養飼料不同有密切關系。ApoE-/-小鼠由于被敲除載脂蛋白E基因，隨自身生長逐漸出現脂代謝紊亂異常，進而導致脂質積聚，加以采用高脂高膽固醇飼料喂養，加速了動脈粥樣硬化的進程，引起模型組小鼠體質量增量與空白組C57BL/6小鼠相比顯著增加。艾灸組小鼠體質量平均值低于空白組，艾煙組小鼠體質量在某些實驗時間節點也低于空白組，這可能是艾灸和艾煙改善脂質積聚，減緩動脈粥樣硬化進程的良性結果。

肺組織HE染色病理切片顯示艾灸及艾煙對肺組織無明顯影響。黃劍等［7］通過不同濃度艾煙干預12周對大鼠肺和骨骼肌的結果顯示，亞急性毒理實驗低、中、高濃度艾煙（艾煙濃度分別為2.5～3.5、8.0～10.0、27.0～29.0 mg/m3）對大鼠肺組織未見明顯損傷，與本實驗結果一致。其中高濃度艾煙組濃度為27.0～29.0 mg/m3，遠遠高于艾灸診室的艾煙濃度3.54 mg/m3［8-9］。本實驗艾煙組濃度為5～15 mg/m3，艾煙的濃度遠低于可吸入顆粒物的風險濃度。因此艾灸及艾煙對小鼠肺組織無影響，證明艾灸及艾煙具有一定的安全性。

在整個動脈粥樣硬化的進程中，炎癥反應貫穿始末。在這一炎性進展中，首先產生的是內皮功能損傷以及功能障礙，進而激發一系列的炎癥反應，產生大量的炎性因子浸潤血管壁，參與動脈粥樣硬化斑塊的發生及發展［10］。這些炎性因子又分為促炎性因子和抑炎性因子，在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中起著十分重要的作用。IL-4主要由Th2細胞產生，是典型的抑炎性因子，其抑制炎癥反應的主要機制是通過抑制單核-巨噬細胞以及IFN-γ、白細胞介素-1（IL-1）等Th1細胞因子，進而抑制動脈粥樣硬化進程中的炎癥反應［11-13］。因此IL-4被認為是一種抗炎細胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干擾素，主要由平滑肌細胞、巨噬細胞和Th1細胞分泌，又被稱為“巨噬細胞活化因子”，具有激活巨噬細胞、血管內皮細胞、NK細胞并促進其功能的作用［14-15］。與此同時可產生炎性細胞因子、氧自由基和金屬蛋白酶，進而激發炎癥反應。大量的研究表明，IFN-γ在動脈粥樣硬化中高水平表達［16］。IFN-γ的促炎作用主要是通過旁分泌和自分泌途徑引起局部炎癥反應，從而減少平滑肌細胞的浸入和再生、大量的減少膠原合成、增加細胞外基質降解蛋白的過度表達，進而導致動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄并且抑制纖維帽的形成，最終加速了易損性斑塊的形成進程［17］。有研究者發現，被試小鼠施行基因敲除術造模成缺乏內源性IFN-γ的小鼠病變斑塊中巨噬細胞含量減少，斑塊纖維化程度升高，因此其動脈粥樣硬化病癥的進展速度和普通小鼠相比有所減緩，病變程度明顯減輕［18-19］。本實驗運用艾灸及艾煙作為干預手段，觀察艾灸及艾煙在動脈粥樣硬化過程中的抗炎作用。結果顯示模型組IL-4水平降低、IFN-γ水平上升，反映出模型組小鼠動脈粥樣硬化過程中的炎性反應，艾灸及艾煙組IL-4較模型組水平上升、IFN-γ水平下降，說明艾灸可抑制促炎性因子IFN-γ的產生、促進抑炎因子IL-4的釋放，能明顯降低動脈粥樣硬化過程中的炎性反應，起到了抗炎作用。綜上，艾灸及艾煙具有一定的安全性，在防治動脈粥樣硬化的過程中有確切的作用，其機制可能與降低動脈粥樣硬化中的炎性反應有關。