四季海棠無性系變異離體篩選與變異頻率控制

翟懿銘， 雪文晶， 張 黎

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

四季海棠（begonia semperflorens）又名四季秋海棠、蜆肉海棠，適合在潮濕、半陰、溫暖的環(huán)境中生長[1]。因其具有花色艷麗、花期長等特點(diǎn)，是優(yōu)良的園林觀賞植物和家庭觀賞花卉。四季海棠通常采用播種與扦插方法繁殖，兩種繁殖方法出苗率不易控制，隨著繁殖次數(shù)的積累，后代品質(zhì)逐漸降低、株型變異、葉色變化，抗性變差。四季海棠無性系建立是進(jìn)行種苗快速繁殖的有效方法之一[5]，而四季海棠品種無性系建立過程中，也會(huì)有一定變異性狀的出現(xiàn)。無性系變異的發(fā)生，嚴(yán)重影響了應(yīng)用組培技術(shù)進(jìn)行快繁的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)效益[2]。變異苗觀賞性及再生能力差，采用無性提純的方法剔除變異植株，篩選優(yōu)質(zhì)種苗。目前，對四季海棠組培苗變異的研究空白，但變異在建立無性系過程中日益突出的不利影響逐漸顯現(xiàn)，組培變異的篩選和控制顯得愈加重要。

1 材料與方法

1.1 材料

以四季海棠（銅葉猩紅色Bronze Scarlet）組培繼代試管苗為試驗(yàn)材料，選取生長健壯的繼代組培苗和具有明顯特征的變異組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 四季海棠繼代增殖培養(yǎng)出現(xiàn)的變異類型 選取四季海棠的莖段作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 調(diào)至6.5，剪除瓶苗氣生根，將莖段切為長1.5～2.5 cm 小節(jié)，接種于增殖培養(yǎng)基，每瓶接種2～3 株。將增殖的叢生無菌芽苗再次分割、繼代。培養(yǎng)條件（光照24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強(qiáng)度2 400 lx）。觀察四季海棠的外觀形態(tài)并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計(jì)四季海棠出現(xiàn)的變異類型。

1.2.2 繼代次數(shù)對四季海棠變異的影響 將四季海棠繼代増殖培養(yǎng)第4 代至第10 代的標(biāo)準(zhǔn)苗，分別轉(zhuǎn)接于MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每瓶接種2 株，每處理接種50 瓶，重復(fù)3 次，培養(yǎng)條件（光照24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強(qiáng)度2 400 lx），90 d 后統(tǒng)計(jì)變異率。

1.2.3 繼代周期對四季海棠變異的影響 將生長30、60、90 d 的標(biāo)準(zhǔn)苗分別轉(zhuǎn)接于 MS 培養(yǎng)基中，每瓶接種2 株，每處理接種50 瓶，重復(fù)3 次，培養(yǎng)條件（光照 24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強(qiáng)度 2 400 lx），90 d 后觀察繼代周期對四季海棠無性系變異影響。

1.2.4 提純復(fù)壯試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取繼10 代的喬化變異苗和矮化變異苗，設(shè)置變異苗的繼代周期為30、60、90 d，分別接種于MS 繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)處理接種20 瓶，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件與繼代培養(yǎng)條件一致，90 d 后統(tǒng)計(jì)四季海棠組培變異苗的復(fù)壯率。

1.3 統(tǒng)計(jì)與處理

增殖率=總芽數(shù)/存活外植體數(shù)，

變異率=出現(xiàn)變異的植株/存活總數(shù)，

葉面積：長乘寬葉面積系數(shù)法。

使用 Excel、DPS、Origin 進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四季海棠組培苗變異類型

由表1 可知，四季海棠繼代培養(yǎng)中，隨著繼代次數(shù)的增加，出現(xiàn)兩種變異現(xiàn)象：葉片變小、節(jié)間變長，植株細(xì)長彎曲，生長迅速，為喬化變異株；植株矮小、葉柄間距變、葉面積小、長勢差、生長緩慢、葉片少且變形，為矮化變異株。

2.2 四季海棠組培苗正常苗和變異苗性狀差異

由表2 可知，變異對株高的影響，喬化、矮化苗與標(biāo)準(zhǔn)苗之間有顯著差異；變異對于葉片數(shù)的影響，標(biāo)準(zhǔn)苗與喬化苗之間差異顯著，喬化苗與矮化苗之間差異不顯著；變異對莖徑的影響，喬化變異與矮化變異之間無顯著差異，與標(biāo)準(zhǔn)苗之間差異顯著；各處理增殖數(shù)之間差異顯著，標(biāo)準(zhǔn)苗、矮化變異苗、喬化變異苗之間差異顯著。變異對節(jié)數(shù)的影響，喬化變異與矮化變異之間差異顯著，喬化變異苗與標(biāo)準(zhǔn)苗之間差異顯著，矮化變異苗與標(biāo)準(zhǔn)苗之間差異顯著；變異對鮮質(zhì)量的影響，標(biāo)準(zhǔn)苗、喬化變異苗之間差異不顯著，標(biāo)準(zhǔn)苗、矮化變異苗之間差異顯著，喬化變異苗，矮化變異苗之間差異顯著。

2.3 繼代次數(shù)對四季海棠組培苗變異的影響

由圖1A 可知，繼4 代開始，組培苗出現(xiàn)矮化和喬化兩種變異。隨著繼代次數(shù)的增加，兩種類型的變異率均增加，矮化變異率高于喬化變異率，總變異率上升。

圖1B 表明，繼1-4 代四季海棠無變異，繼5 代出現(xiàn)變異，并且變異率呈上升趨勢，繼9 代達(dá)到最大值。繼4 代至10 代范圍內(nèi)，總變異率隨時(shí)間的變化擬合直線回歸方程y=0.9x-0.27，變異率與繼代次數(shù)具有密切正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.448 3。

圖 1C 表明，繼4 代至繼 10 代范圍內(nèi)，兩種不同類型的變異苗總變異率上升。

圖1D 表明，喬化變異苗變異率的變化擬合直線回歸方程y=0.39x- 0.07，變異率與繼代次數(shù)具有密切正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.996 2;矮化變異苗變異率的變化擬合直線回歸方程y=0.53x-0.02，變異率與繼代次數(shù)具有密切正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.960 3。

2.4 繼代周期對四季海棠組培苗變異頻率的影響

由表3 可知，繼代周期不同，四季海棠組培苗的變異率有所不同。繼代30 d 時(shí)，組培苗生長速度快，長勢好，葉片發(fā)育正常，增殖系數(shù)高；繼代90 d，組培苗生長慢，莖變細(xì)弱，并出現(xiàn)變異。繼代時(shí)將變異苗變異部分剔除，同時(shí)轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，但變異性狀未改變。

由表4 可知，喬化苗與矮化苗中，繼代周期的變異率差異顯著。變異率隨著繼代周期的延長而增加，縮短而降低。

表1 四季海棠變異苗類型

表2 四季海棠組培苗標(biāo)準(zhǔn)苗和變異苗性狀差異

表3 繼代時(shí)間對四季海棠組培苗變異頻率的影響

圖1 繼代次數(shù)對組培苗變異率的影響

表4 繼代周期對四季海棠組培苗變異頻率的影響

2.5 四季海棠變異組培苗提純復(fù)壯試驗(yàn)

2.5.1 四季海棠矮化變異組培苗提純復(fù)壯 由表5可以看出，處理天數(shù)對矮化變異苗的影響。株高30 d與 90 d 之間差異顯著，30、90 與 60 d 之間差異不顯著；處理天數(shù)對莖徑的影響，30、60、90 d 之間無顯著差異；各處理節(jié)間長之間差異較大，標(biāo)準(zhǔn)苗，矮化變異苗，喬化變異苗之間差異顯著；變異對節(jié)數(shù)的影響，喬化變異與矮化變異之間差異顯著，喬化變異苗與標(biāo)準(zhǔn)苗之間差異顯著，矮化變異苗與標(biāo)準(zhǔn)苗之間差異顯著。隨著處理天數(shù)的增加，復(fù)壯率呈現(xiàn)下降趨勢。

2.5.2 四季海棠喬化變異組培苗提純復(fù)壯 由表6可知，處理天數(shù)對喬化變異苗的影響，株高30 d 與90 d 之間差異顯著，30、90 與60 d 之間差異不顯著；處理天數(shù)對莖徑的影響，30 d 與60 d、90 d 之間差異顯著，60 d 與90 d 之間無顯著差異。節(jié)間長30 d 與90 d 之間差異顯著，30、90 d 與 60 d 之間差異不顯著；節(jié)數(shù) 30 d 與 90 d 之間差異顯著，30、90 d 與 60 d之間差異不顯著；隨著處理天數(shù)的增加，復(fù)壯率下降。

表5 四季海棠矮化變異組培苗提純復(fù)壯

表6 四季海棠喬化變異組培苗提純復(fù)壯

2.5.3 四季海棠變異組培苗提純復(fù)壯效果比較 由表7 可知，將喬化變異株和矮化變異株分別接種于MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，喬化變異率在提純后，正常苗率為46.6%，喬化變異苗率為53.4%，無矮化變異株出現(xiàn)，表明喬化變異株提純復(fù)壯有效。矮化變異株提純復(fù)壯后正常苗率為0.66%，矮化變異苗率為93.4%，無喬化變異株出現(xiàn)，表明無效。

表7 四季海棠變異組培苗提純復(fù)壯效果比較

2.6 四季海棠在繼代過程中的性狀篩選

由表8 可知，培養(yǎng)30 d 時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)苗、喬化變異株和矮化變異株之間株高無顯著性差異；生長60 d時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)苗與喬化變異苗平均株高間差異不顯著，標(biāo)準(zhǔn)苗、喬化變異苗與矮化變異苗差異顯著；生長90 d 時(shí)，三者平均株高間差異顯著；標(biāo)準(zhǔn)苗生長90 d平均株高10.704 cm，比矮化苗平均值高出58.8%，比喬化苗矮41.23%；標(biāo)準(zhǔn)苗生長60 d 平均株高4.68 cm，比矮化苗平均值高出13.2%，比喬化苗矮3.1%。矮化變異株在生長60 d 后停止生長，喬化變異株在生長90 d 內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)苗相比增值速度快38.36%，兩者為被篩選對象。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

前人對四季海棠的研究主要集中在組培快繁體系的建立[5]和大棚繁育[1]方面，未見有對組培階段變異的研究報(bào)道，本試驗(yàn)以四季海棠組織培養(yǎng)增殖階段組培苗為試驗(yàn)材料，采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，探究四季海棠繼代次數(shù)、繼代周期對變異的影響以及提純復(fù)壯。胡盼盼等[2]、張馨宇等[3]總結(jié)了草莓組培中變異發(fā)生的原因和有效控制變異的途徑，指出組培過程中變異的普遍性，顯著影響植物的遺傳穩(wěn)定性，制約了組培技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。韋家川等[4]研究了香蕉試管苗增殖階段中出現(xiàn)的變異類型，表明變異與品種、繼代培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)條件有關(guān)。曾少玲等[7]研究了代數(shù)、激素使用和分化途徑對香蕉生長的影響，表明香蕉無土栽培的繼代代數(shù)不宜超過10 代。張盛圣[6]指出，繼代次數(shù)對綠蘿的葉色變異有顯著影響，而且對發(fā)生變異的植株剔除，對其進(jìn)行分離提純有利于植株繼代變異率降低且能夠持穩(wěn)定、較低的變異率。王安石等[8]研究了紅掌組培苗工廠化生產(chǎn)的變異控制技術(shù)，指出控制組培體系的變異需要從外植體選擇到繼代培養(yǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控，這與本試驗(yàn)繼代次數(shù)對四季海棠組培苗的變異影響相符。對無性系變異篩選及調(diào)控途徑的研究，將有可能揭開表觀遺傳變異的真相，為如何有效控制組培變異和減少變異對生產(chǎn)的不利影響提供更多切實(shí)可行的途徑。

表8 四季海棠組培苗不同培養(yǎng)天數(shù)下株高差異顯著性

3.2 結(jié)論

（1）四季海棠組培苗變異類型為喬化變異和矮化變異兩種，喬化變異率為2.9%，矮化變異率為3.8%；

（2）四季海棠組培苗繼代4 次后，出現(xiàn)變異現(xiàn)象，變異率隨繼代次數(shù)增加而增加。

（3）四季海棠組培變異率隨著繼代時(shí)間增加而增加。

（4）四季海棠變異組培苗喬化變異提純復(fù)壯率達(dá)46.6%，矮化變異復(fù)壯為0.66%。