不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素*

裴泓霖 王 犖 譚八梅 李偉嘉 甄 昊 丁 君 常亞青

(大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點實驗室 大連 116023)

刺參(Apostichopus j aponicus)因具有豐富的營養和藥用價值，深受消費者青睞。隨著刺參養殖產業的不斷發展，池塘養殖已成為刺參增養殖的重要方式(常亞青等, 2006)。在集約化養殖過程中，殘餌及養殖生物糞便的堆積易引起底質惡化，對養殖生態系統健康存在潛在危害(董雙林, 2015; 王姣, 2016)。

養殖池塘沉積物菌群作為養殖生態系統的重要組成部分，不僅在水體物質循環及能量流動過程中發揮巨大的作用(Bentzon-Tilia et al, 2016)，對其養殖生物的生長、消化、免疫、疾病等均存在相關性(Becker et al, 2004; Wang et al, 2005; 高菲等, 2010)。研究表明，藍細菌(Cyanobacteria)能將溶解有機碳轉化為自身的顆粒有機碳，從而完成碳轉換與儲存(周偉華等,2007)；假單胞菌屬(Pseudomonas)菌群能利用反硝化作用將硝酸鹽還原為氮氣(肖晶晶等, 2009)；鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)中某些菌種對有機磷和無機磷的分解具有明顯作用(孫亞凱, 2006)；脫氮硫桿菌(Thiobacillus denitrificans ) 、 反 硝 化 硫 微 螺 菌(Thiomicrospira deni trificans) 、 多 樣 硫 桿 菌(Thiobacillusd versutus )等菌群能從多種還原態無機硫的氧化中獲得能量，同時，還原硝酸鹽或亞硝酸鹽產生氮氣(Pokorna et al, 2015)；嘉利翁氏菌屬(Gallionella)、海桿菌屬(Mariprofundus)、Sideroxydans 能夠將Fe2+氧化為Fe3+，而Fe3+可以作為電子受體進行能量代謝，從而完成鐵循環(Edwards et al, 2003; Emerson et al,2004)。因此，有效利用某些微生物的生理功能來保持養殖池塘生態系統的微生態平衡，對防治池塘養殖環境惡化以及促進養殖生物健康生長具有重要意義(王鑫毅等, 2019)。然而，養殖池塘生態系統菌群結構極易受到外部環境理化因子的影響，季節變動、營養物質輸入等變化均可造成池塘養殖環境菌群種類和豐度的改變，間接影響養殖生物的生長及健康(Sunde et al, 2001; Suzuki et al, 2019)。

為探明不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素，本研究選取遼寧省營口地區刺參養殖池塘為研究對象，基于高通量測序技術，揭示不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群結構的季節性差異和共性，查明影響刺參養殖池塘沉積物菌群結構的主導環境因子，以期為刺參養殖池塘微生態調控和綠色健康養殖提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取遼寧營口(40°37′46″ N；122°8′59″ E)刺參養殖池塘為研究對象，于2019 年1 月(冬季)、4 月(春季)、8 月(夏季)、10 月(秋季)，利用柱狀采泥器，在同一刺參養殖池塘對角線兩側離岸1.5 m 及正中間處采集表層(5 cm)沉積物樣品，裝入無菌離心管，-80℃冷凍保存。將每次采集的5 個沉積物樣品等量混勻送檢，每個樣品進行3 次重復。

采樣池塘僅養殖刺參單一品種，放養刺參密度約為8～10 頭/m2，刺參規格約為100 g/頭。池塘面積約為0.1 km2，水深2～3 m，底質多泥質，水源來自近海海域，利用潮汐帶來的潮差進水和排水。全年不投喂飼料及益生菌，保證刺參自然生長。

1.2 環境因子測定

環境因子監測點位同沉積物采樣點，每個采樣點測定環境指標均進行3 次重復。采用HACH(HQd)水質分析儀器，在養殖池塘現場測定溫度、鹽度和pH。沉積物總有機碳(TOC)的測定采用重鉻酸鉀氧化-還原容量法，總氮(TN)采用過硫酸鉀氧化法，總磷(TP)采用鉬銻抗分光光度法，氨氮(-N)采用次溴酸鹽氧化法，硝酸鹽(-N)采用鎘柱還原法，亞硝酸鹽(N)采用萘乙二胺分光光度法，磷酸鹽(-P)采用磷鉬藍分光光度法，硫化物采用亞甲基藍分光光度法，氧化還原電位采用堿性高錳酸鉀法。

1.3 DNA 提取

選用OMEGA Soil DNA 試劑盒提取刺參養殖池塘環境樣品總DNA，為確保DNA 無降解無污染，DNA 濃度要求≥50 ng/μl，OD260/280=1.8～2.0。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，條帶清晰完整、無拖尾，質量合格。

1.4 PCR 擴增與高通量測序

細菌16S rRNA 基因V3～V4片段的擴增引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-G ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)，應用Illumina MiSeq測序平臺完成序列測序。

1.5 數據分析

采用Usearch 軟件，以97%閾值開展OTU(Optical Transform Unit)操作分類單元聚類(Blaxter et al ,2005)。選用RDP classifier 軟件(Wang et al, 2007)進行物種分類操作，閾值設置為0.8，低于該閾值的分類結果被劃歸為Unclassified 一類。利用Qiime 軟件(Caporaso et al, 2010)進行多樣性分析。基于OTU 聚類和環境因子信息，利用R 語言的Vegan package(Oksanen et al, 2010)進行環境因子相關性分析。通過最大似然法構建進化樹。根據物種分類結果得到不同水平上各Rank 的豐度值，采用STAMP 軟件(版本2.1.3)，比較樣本之間豐度差異，P＜0.05 為差異顯著，比較樣本組間豐度差異。

2 結果與分析

2.1 環境因子監測

遼寧營口刺參養殖池塘不同季節沉積物環境因子監測數據如表1 所示。根據中華人民共和國國家標準《海洋沉積物質量(GB 18668-2002)》，所有樣品均符合國家Ⅰ類沉積物標準。所監測的環境因子理化指標，均呈顯著的季節性差異。其中，總氮、氨氮、硝酸鹽、總磷和硫化物含量均在夏季最高；TOC 含量在秋季最高，春季最低。

2.2 高通量測序結果

不同季節刺參養殖池塘沉積物樣品高通量測序結果見表 2，從表 2 可以看出，共得到原始序列37690～87024 條，有效序列41562～79288 條，聚類于36980～3913 個 OTUs。樣品測序覆蓋率為 95.9%～99.6%，表明測序結果可以真實反映樣本信息。稀釋曲線趨于平坦，表示測序數據深度足夠反映樣品的多樣性。

2.3 α 多樣性分析

Chao1 和Ace 指數常用于估算樣品中菌群的豐度；Shannon 和Simpson 指數常用于估算樣品中菌群的多樣性。

表1 不同季節刺參養殖池塘沉積物環境因子Tab.1 Environmental factors of sediment in Apostichopus japonicus culture pond in different seasons

表2 高通量測序結果Tab.2 Results of high-throughput sequencing

比較不同季節α 多樣性指數得出(圖1)，營口地區刺參養殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性具有顯著性季節差異。其中，夏季菌群豐度和多樣性顯著升高；其他季節菌群豐度和多樣性均有不同程度的下降，具體表現為秋冬兩季菌群豐度極顯著性下降(P＜0.01)，且冬季菌群物種豐度達四季最低。

2.4 β 多樣性分析

在OTU 水平上，根據加權Unifrac 距離對不同季節樣本進行三維主坐標分析(圖 2)。其中，PCoA1(Principal Co-ordinates analysis)的貢獻率為55%，PCoA2的貢獻率為35%，PCoA3 的貢獻率為4%，總貢獻率為94%。同一季節樣品均聚集在一起，顯示出較好的生物學重復性。不同季節相比較，秋季與其他季節沉積物菌群結構具有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 α 多樣性指數Fig.1 Alpha diversity index

圖2 PCoA 三維分析Fig.2 PCoA three-dimensional analysis

2.5 菌群結構特征

基于GraPhlAn 分類和系統發育信息可視化圖(圖3)可以看出，不同季節刺參養殖池塘沉積物第一優勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)(相對豐度＞43.19%)，次優勢菌門存在顯著差異。其中，綠彎菌門(Chloroflexi)(相對豐度＞7%)為春季次優勢菌門；擬桿菌門(Bacteroidetes)(相對豐度＞8.13%)為夏季次優勢菌門，厚壁菌門(Firmicutes)(相對豐度＞17.96%)為秋、冬季次優勢菌門。

菌屬水平下，優勢菌屬呈現出顯著的季節性差異(P＜0.05)。其中，春季優勢菌主要隸屬于Sulfurovum、Thioprofundum、除硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、Desulfosarcina 和Desulfopila。夏季優勢菌屬主要隸屬于Sulfurovum、Halioglobus、Haliea、Thioprofundum、Desulfuromonas、Desulfopila 和Desulfobulbus。秋季優勢菌主要隸屬于Sulfurovum、Desulfuromonas、Desulfuromusa、Desulfosarcina、Desulfopila 和海桿菌屬(Marinobacter)。冬季優勢菌主要隸屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Desulfuromonas、Pelobacter、Desulfosarcina、Desulfopila、Desulfobulbus、不動桿菌屬(Acinetobacter)和Exiguobacterium。春、夏、秋、冬 4 季沉積物優勢菌屬均包含脫硫八疊菌Desulfosarcina、Desulfuromonas 和Desulfopila。

LEfSe (LDA Effect Size)差異性分析結果顯示(圖4)，共有不同分類水平的98 個細菌群類在4 個季節中存在顯著差異。其中，變形菌門在4 個季節中都存在差異菌群，如檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬是隸屬于春季的差異菌屬；外硫紅螺旋菌科(Ectothiorhodospiraceae)、交替單胞菌目(Alteromonadales)是隸屬于夏季的差異菌目； 彎曲菌目(Campylobacterales)、Sulfurovum 是隸屬于秋季的差異菌；著色菌目Chromatiales、Thiohalomonas 是隸屬于冬季的差異菌目。此外，春季刺參養殖池塘沉積物差異菌門主要隸屬于擬桿菌門(Bacteroides)和酸桿菌門(Acidobacteria)，其代表性差異菌屬分別為Cytophagla和Gp21。夏季沉積物差異菌門主要隸屬于酸桿菌門、疣微菌門(V e r r u c o m i c r o b i a)和浮霉菌門(P l a n c t o m y c e t e s)，分別以 G p 2 3、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)和浮霉菌科(Planctomycetaceae)為代表。秋季沉積物差異菌門隸屬于擬桿菌門和厚壁菌門，其代表性差異菌屬為 Mangrovibacterium 和Natranaerovirga。冬季沉積物差異菌門則隸屬于放線菌門(Actinobacteria)以Actinomycetales 為代表。

2.6 菌群結構與環境因子相關性分析

RDA 是將對應分析與多元回歸分析混合的一種分析方法。營口地區刺參養殖池塘沉積物菌群與環境因子RDA(Redundancy Analysis)分析結果顯示(圖5)，春季和夏季在第2 象限中基本處于同一位置，顯示影響春夏兩季沉積物菌群結構的環境因子相似。根據環境因子與原點連線的長度可知，溫度、TN、pH 和TOC 是營口刺參養殖池塘沉積物菌群的主導環境因子。其中，溫度、TN、pH 與春、夏季刺參養殖池塘沉積物菌群相對豐度呈正相關，與秋、冬季菌群相對豐度呈負相關；TOC 與秋、冬季刺參養殖池塘菌群相對豐度呈正相關，與春、夏季菌群相對豐度呈負相關。

圖4 不同季節沉積物菌群LEfSe 分析Fig.4 LEfSe analysis of sediment bacterial community in different seasons

圖5 沉積物菌群與環境因子RDA 分析Fig.5 RDA analysis of sediment bacterial community and environmental factors

不同季節刺參養殖池塘沉積物差異菌群與主導環境因子相關性分析結果見表3。其中，擬桿菌門與TOC 含量呈極顯著負相關(P＜0.01)，表明擬桿菌門受沉積物有機物質含量影響顯著。酸桿菌門與pH 和TN 呈極顯著正相關(P＜0.01)。疣微菌門和浮霉菌門與TN 含量呈極顯著正相關(P＜0.01)。厚壁菌門與TN 呈極顯著負相關(P＜0.01)，與TOC 含量呈極顯著正相關(P＜0.01)。放線菌門則與pH 和TOC 呈顯著相關性(P＜0.05)。

表3 沉積物優勢菌群與主導環境因子相關性分析Tab.3 Correlation analysis between dominant bacterial community and environment factors in sediment

3 討論

3.1 不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群多樣性

微生物是養殖池塘生態系統的重要組成部分，在生態系統物質循環和能量流動過程中發揮著重要作用，對維持生態系統平衡具有重要意義(Rungrassamee et al, 2016; Xiong et al, 2016; 金笑等, 2017)。本研究結果顯示，營口地區不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性呈現出顯著的季節演替特征。其中，夏季刺參養殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性最高，冬季沉積物菌群豐度和多樣性則最低。已有的研究表明，溫度是影響環境微生物生命活動的重要因素之一，高溫通過加速細菌體內酶活性，促進微生物代謝，加速有機物分解，為微生物生長繁殖提供有利條件(李彬等, 2010; Cardona et al, 2016)。同時，氮、磷等營養物質的增多，也為細菌生長創造了適宜的條件，使菌群豐度和多樣性更豐富(董學興等, 2019)。營口地區夏季刺參養殖池塘水環境溫度和氮磷含量相對較高，為沉積物中微生物的繁殖提供了良好的生存環境，因此，夏季沉積物菌群豐度和多樣性顯著高于其他季節。

3.2 不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群結構及其影響因素

本研究中，不同季節營口地區刺參養殖池塘沉積物第1 優勢菌門均為變形菌門，與已有的研究報道一致(竇妍等, 2014、2016; 丁斯予等, 2019)。變形菌門作為養殖池塘環境中的第1 優勢菌門，主要是由其在原核生物分子生物學分類中的絕對優勢所決定的(Gupta et al, 2000)。變形菌門下多個細菌群類均為池塘底棲環境中常見的固氮菌，參與池塘生態系統氮循環，在池塘養殖生態系統中占據著重要的生態學地位(劉思亮等, 2002; 龔駿等, 2010)。刺參養殖池塘沉積物除變形菌門為第1 優勢菌門外，其他優勢菌門為擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門、厚壁菌門等，與營底棲生活的縊蟶(Sinonovacula const ricta)相近(王毅鑫等, 2019)，與雜食性的羅非魚池塘沉積物菌群差別較大(史麗娜等, 2015)。養殖品種食性的差異會導致飼料投入不同，造成池塘沉積物中有機物和營養鹽濃度產生差異。除飼料不同之外，刺參的攝食方式為吞食沉積物，造成沉積物菌群結構發生一定改變(于東祥,2010)。因此，刺參養殖池塘沉積物菌群結構具有特異性。

比較不同季節刺參養殖池塘沉積物菌群結構特征的結果顯示，刺參養殖池塘沉積物菌群存在顯著的季節性差異，特異性菌群相對豐度與其生境因子之間存在顯著性相關，影響沉積物菌群的主導環境因子為溫度、TOC、TN 和pH，且所有主導環境因子均呈現出顯著的地域差異。已有的研究表明，微生物生長繁殖所需的營養物質主要依靠環境中的無機鹽和有機物，其群落組成對環境因子變化有著較強的敏感性(王軼南等, 2010; Bell et al, 2013; 李建光等, 2014;Yang et al, 2015; Amabebe et al, 2020)。微生物菌群特征是其生境的反映，與環境理化性質密切相關且相互限制影響(閆法軍等, 2014)。其中，春季刺參養殖池塘沉積物特異性菌群主要以擬桿菌門為代表。擬桿菌門細菌與微生物蛋白質和脂類等有機物的轉化密切相關(Ren et al, 2015)，是維持環境碳循環的主要動力，且與春季沉積物環境中TOC 含量顯著性相關。夏季沉積物特異性菌群以酸桿菌門、疣微菌門和浮霉菌門為代表。夏季隨著溫度的升高，養殖生物代謝加快，排泄物增多，易導致硫、鐵等元素在池底大量堆積，使養殖池塘底部沉積物pH 下降，為具有嗜酸特性的酸桿菌門繁殖提供了有利條件(Barns et al, 2007;劉彩霞等, 2016)。此外，夏季沉積物中含氮物質的增高會造成水體富營養化，導致藍藻暴發，也會對水生生物的生長產生不良影響(付瑩等, 2018)。然而，疣微菌門細菌的存在可以有效利用夏季沉積物環境中的氮元素，加速氮循環進程(Shen et al, 2017)。夏季沉積環境中高含量的氮和硫，則有利于浮霉菌門細菌的生長繁殖(黃佩蓓等, 2014)。厚壁菌門細菌能夠有效利用環境中硝酸鹽和亞硝酸鹽，進而降低沉積物中的氮含量，作為秋季特異性菌群，與其沉積物中較低的氮含量呈現出一致性。冬季隨著氣溫的下降，沉積物中微生物豐度和多樣性均受到不同程度的抑制，而放線菌門細菌因能形成抗逆性極強的芽孢，從而具有極強的環境適應性(王蓉等, 2013)，成為冬季沉積物特異性菌群。此外，放線菌門具有降解淀粉、蛋白等大分子的功能，產生的抗菌素類物質能抑制環境中其他革蘭氏陽性細菌發揮作用，有成為益生菌的潛力(李文均等, 2002)。

值得注意的是，夏季刺參養殖池塘沉積物中厚壁菌門相對豐度極顯著低于其他季節，相對豐度僅為0.5%。而隸屬于厚壁菌門、芽孢桿菌目(Bacillales)的芽孢桿菌屬是典型的益生菌，被廣泛用于水產養殖池塘環境微生態調控(杜佗等, 2017)。芽孢桿菌可以產生多種消化酶和營養物質，供養殖動物吸收利用，還可以通過改善水產動物體內微生態環境進而提高動物機體免疫力，同時，具有凈化水質和清除自由基的功效(蘇艷莉等, 2016)。因此，建議在夏季池塘中添加適當含量的芽孢桿菌，用于協助刺參安全度夏。

4 結論

本研究結果表明，營口地區刺參養殖池塘沉積物菌群豐度和多樣性存在顯著性季節變化特征，溫度、總有機碳、總氮和pH 是影響沉積物菌群的主要環境因子。本研究初步探明沉積物菌群與主導環境因子間的相關性，而菌群與環境因子間的互作機制還有待于進一步深入探究。