基于MSAP 技術的刺參選育群體基因組表觀與序列遺傳多樣性分析*

左 閃 溫爭爭 周紅學 倪樂海 孫國華馮艷微 王衛軍 楊建敏

(1. 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 上海海洋大學 上海水產養殖工程技術研究中心 上海 201306；3. 魯東大學農學院 煙臺 264025；4. 山東省農業農村廳 濟南 250013；5. 山東省漁業技術推廣站 濟南 250013；6. 煙臺海育海洋科技有限公司 煙臺 264001)

刺參(Apostichopus j aponicus)，又稱仿刺參，生活在巖礁底的淺海中，廣泛分布于西太平洋沿岸淺海。隨著刺參養殖規模的迅速擴大，刺參產業發展面臨的種質退化、病害頻發、極端氣候災害等嚴峻問題日益突出(高凱倫, 2018; 張春云等, 2004)。目前，刺參苗種產業中親參的來源主要是遺傳背景不清楚的“野生”刺參以及累代繁育的人工養殖刺參，由此構成的苗種繁育的種質基礎群體，其后代往往出現生長緩慢、個體差異大、應激性差、抗逆抗病性弱等現象，嚴重影響了刺參養殖產業的健康發展(侯西坦, 2016;曲洪霞等, 2016)。與此同時，近年來氣候變化帶來的極端高溫天氣造成山東、遼寧等大面積養殖池塘刺參大量死亡，對沿海刺參養殖產業帶來沉重打擊。因此，培育刺參優良抗逆新品種是解決刺參優良種質匱乏和安全度夏瓶頸問題的重要出路，刺參種業關乎刺參產業乃至整個水產養殖業的提質增效和穩定發展。針對目前對優良種質的需求，全國多團隊進行了不同表型特征刺參的新品種創制和研發，本課題組經過連續4 代多年的高溫馴化和脅迫選育，培育出一個高溫耐受性能提高的刺參新品系，在養殖生產試驗中表現出度夏成活率高、產量提高等優勢。

近20 年以來，表觀遺傳學研究取得了長足進展，已有研究表明，遺傳表型改變不僅來源于DNA 序列的改變，也存在不依賴序列變化的表觀遺傳修飾。表觀遺傳變異研究主要有DNA 的甲基化修飾、核小體中組蛋白翻譯后修飾、非編碼RNA 調控、組蛋白變體及受催化的染色質重塑等方面(Wolffe et al, 1999;王淑妍等, 2016; 康靜婷等, 2013)。DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的一個重要方式，也是目前在機制方面研究相對最多、最深入的表觀遺傳過程(邱崢艷等,2012)。環境條件變化能夠誘導DNA 甲基化發生變異，并且環境條件變化能夠誘導具有持續性和可遺傳性的DNA 甲基化和表觀變異(李佳蓉等, 2018)。某些DNA 甲基化在多種表觀遺傳機制中具有中心協調的作用，可以在后代進行穩定傳遞，DNA 甲基化的這些特性決定其在動植物育種中，特別是抗逆性狀的遺傳改良方面具有非常大的應用潛力。在我們的刺參耐高溫品系的選育過程中，其抗逆耐高溫性狀是在脅迫環境條件下馴化和篩選獲得，這種優良性狀是否具有表觀遺傳層面的遺傳基礎，需要進行探究。

甲基化敏感擴增多態性(Methylation-sensitive amplification polymorphisms, MSAP)技術是DNA 甲基化模式研究最有效且經濟實用的應用技術(Angers et al, 2010; Guarino et al, 2019; Zhao et al, 2015)，由于采用的限制酶的位點特性，可以同時進行甲基化敏感位點表觀遺傳多樣性分析，也可以進行非甲基化多態位點的遺傳多樣性分析(吳彪等, 2015; Zhao et a l,2015)。本研究運用MSAP 技術分析了刺參育種過程中的選育基礎群體和2 個選育群體(選育F1代和選育F4代) 3 個刺參群體的DNA 甲基化多態性和模式，揭示不同刺參群體的表觀遺傳多樣性及其遺傳結構，就選育活動對基因組DNA 甲基化的影響進行探討，以期從表觀遺傳學角度來闡釋選育過程中的遺傳基礎的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用群體為刺參耐高溫新品系選育過程中的選育基礎群體F、選育F1代和選育F4代。其中，基礎群體為4 個種質保護區野生刺參群體繁殖獲得，選育F1代和F4代為選育過程代表群體，是采用群體選育技術經過浮游幼體期27℃熱馴化120 min 和16 月齡期32℃高溫脅迫72 h 淘汰選擇，并輔以生長速度篩選獲得。在選育生產過程中，由于親本較為珍貴，F2和F3親本較少，沒有保留用作分析樣本，F1和F4作為選育初和選育完成群體可以代表選育過程且能體現選育的遺傳特征。3 個刺參群體分別記作F、F1和F4。從3 個群體中分別隨機選取18 月齡、體重為200 g 左右的15 頭刺參保存待分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 剖取待測刺參的肌肉附帶內膜組織，用于全基因組DNA 提取，采用改進的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法進行(全志星等,2017)。取組織塊約50 mg，置于預冷的研缽中，在液氮中充分碾磨后，加入65℃預熱的CTAB 裂解液[2% CTAB (W/V)，0.2 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)，0.05 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.4 mmol/L NaCl，2% β-巰基乙醇(V/V) 1 ml，1% PVP-40(W/V)]，等體積氯仿抽提上清液后，用3 mmol/L 醋酸鉀和異丙醇沉淀DNA，最后經無水乙醇漂洗，加入1 mmol/L NaCl 溶解DNA，通過1.5%瓊脂糖電泳檢測DNA 是否降解，檢測OD260nm/280nm以確定DNA 的純度，存于-20℃中備用。

1.2.2 MSAP 實驗流程 參考郭婷婷等(2013)的方法并進行優化，所用引物和接頭序列見表1。

選用EcoRⅠ、MspⅠ和HpaⅡ進行酶切反應，分別以2 種酶切組合進行樣品DNA 的酶切，即EcoRⅠ+HpaⅡ和EcoRⅠ+MspⅠ。10 μmol/L 的EcoRⅠ-A和100 μmol/L 的M-H-A 單鏈等體積混合制備接頭，0.5 μl 接頭與上述酶切產物15 μl、175 U 的T4 連接酶在25 μl 連接體系下，16℃水浴過夜，獲得連接產物。以引物E00-A 和MH00-T 進行預擴增，PCR 反應條件：94℃預變性2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環，72℃延長5 min，最后4℃保存。以選擇性擴增引物的不同組合進行選擇性擴增，PCR 反應條件：94℃預變性2 min，94℃ 30 s，65℃ (每個循環遞減1℃) 30 s，72℃ 1 min，共進行10 個遞減循環；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，20 個循環，72℃保溫延長5 min，最后4℃保存。

表1 MSAP 引物和接頭序列Tab.1 MSAP primer and linker sequence

1.2.3 MSAP 數據分析 通過優化MSAP 實驗條件，從不同引物組合中篩選多態性好、重復性高、條帶清晰的10 對引物組合進行實驗分析。利用Quantity One 軟件標記出5%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中100～500 bp 區間擴增出來的條帶。根據擴增產物在2 個泳道內有無的情況，可將條帶類型分為4 種，Ⅰ型2 個泳道均有條帶；Ⅱ型H 泳道有帶，M 泳道無帶，代表半甲基化位點；Ⅲ型H 泳道無帶，M 泳道有帶；Ⅳ型2 個泳道均沒有帶。根據Cervera 等(2002)提出的方法，把MSAP 二維矩陣數據分為甲基化敏感位點(Methylation-susceptible loci, MSL)和非甲基化位點(Non-methylated loci, NML)兩大類。MSL 指只能夠被HpaⅡ或MspⅠ中的一種酶切開，為(1,0)或(0,1)情況，即甲基化模式(Ⅱ、Ⅲ型)記為1，其余模式(Ⅰ、Ⅳ型)記為0。NML 指同時能被HpaⅡ和MspⅠ酶切開，為(1,1)情況，即甲基化模式Ⅰ型記為1，其余模式(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)都記為0。

利用Popgene 軟件對等位基因數、雜合度、香農多態性指數等種群遺傳學參數進行分析和計算。通過NTsys 軟件將0/1 矩陣轉化成相應的MSP(甲基化敏感位點)和MISP(甲基化不敏感位點)聚類圖譜，基于甲基化敏感位點的表觀遺傳距離和基于非甲基化位點的遺傳距離進行Mantel 檢驗。

2 結果與分析

2.1 刺參群體MSAP 多態性及遺傳多樣性

刺參群體遺傳多樣性的各項指標顯示(表 2)，10 對引物獲得的806 個位點中，多態性位點數量為698 個，多態性位點的百分比為86.60%，表明本研究所用引物組合適用于刺參群體表觀遺傳多樣性的研究。10 對引物觀察等位基因數(Na)平均值為1.8767，有效等位基因數(Ne)平均值為1.4809，平均雜合度(H)為0.2897，平均香農多態性指數(I)為0.4439。引物組合E3M3 多態性位點百分比高達95.51%，產生的Na、Ne、H 和I 高于其他所有引物組合，是遺傳多樣性貢獻率最大的引物對；引物組合E1M1 的Ne、H 和I均為最低值，是遺傳多樣性貢獻率最低的引物對。

2.2 MSL/NML 遺傳多樣性信息

分別對3 個刺參群體進行甲基化敏感位點(MSL)和非甲基化位點(NML)的多態性統計與分析(表3)，NML 百分比在47.7%～50.1%范圍內；香農多態性指數I 為0.3981～0.4662，Nei's 基因多樣度H 為0.2264～0.2475，選育基礎群體F 的種群多態性指數最高。MSL百分比在63%～65%范圍內；I 為0.5873～0.6030，H為0.2598～0.2892。無論是以MSL 還是NML 計算的遺傳多態性指數，選育F1代和F4代均小于選育基礎群體F，表明選育降低了群體的遺傳多樣性。選育F1代和F4代的NML 百分比分別為50.1%和47.7%；I 分別為0.4337 和0.3981；H 分別為0.2460 和0.2264。選育F1代和F4代的MSL 百分比分別為66%和65%；I 分別為0.5995 和0.5873；H 分別為0.2654 和0.2598。無論是以MSL 還是NML 計算的遺傳多態性指數，選育F1代均高于F4代，說明隨著群體選育代數的累加，群體遺傳多樣性具有逐漸降低的趨勢。同時，基于MSL 計算都大于基于NML 得到的遺傳多樣性，表明表觀變異出現頻率高于基因序列遺傳變異。

表2 引物組合的遺傳多樣性信息Tab.2 Genetic diversity information of primer combinations

表3 3 個刺參群體MSAP 多態性及遺傳多樣性Tab.3 MSAP polymorphism and genetic diversity of three A. japonicus populations

2.3 刺參群體的甲基化模式

根據MSAP 獲得的4 種帶型進行不同甲基化模式的統計，表4 為3 個刺參群體甲基化類型統計結果，類型Ⅰ條帶數百分比為48.39%～51.86%，選育基礎群體獲得的類型Ⅰ條帶數最多，為418 條；類型Ⅳ條帶數最少，占比12.28%～13.03%。類型Ⅱ條帶數百分比為15.76%～19.98%，選育F1和F4代獲得的類型Ⅱ條帶數較選育基礎群體有所增高，其中，F4代最多，為161條。選育F1和F4代的類型Ⅲ和類型Ⅳ條帶數相近。半甲基化和全甲基化總體稱整體甲基化，將整體甲基化、半甲基化和全甲基化模式比較分析發現(圖1)，選育基礎群體半甲基化低于全甲基化，2 個選育群體半甲基化位點升高，整體甲基化水平高于選育基礎群體，選育F1和F4代呈現相同的改變趨勢。

表4 3 個刺參群體DNA 甲基化類型統計Tab.4 Statistics of DNA methylation types of three A. japonicus populations

圖1 3 個刺參群體甲基化狀態比較Fig.1 Comparison of the methylation status of three A. japonicus populations

2.4 表觀遺傳距離與遺傳距離的Mantal 檢驗

對刺參3 個群體基于甲基化敏感位點和非甲基化位點的遺傳距離進行Mantel 檢驗，結果顯示，相關系數r 值為0.305～0.480，平均值為0.373，種群的表觀遺傳距離與序列遺傳距離的相關性均達到顯著水平(P＜0.01)，說明基于甲基化敏感位點計算的表觀遺傳變異一定程度上依賴于序列遺傳變異(表5)。

表5 3 個刺參群體種群遺傳距離與表觀遺傳距離的Mantel 檢測Tab.5 Mantel detection of population genetic distance and epigenetic distance of three A. japonicus populations

3 討論

3.1 DNA 甲基化與遺傳育種

生物體通過基因表達的改變來實現表型上的改變，借助表型上的變化來不斷進行生理及行為上的調節，進而適應環境變化，在基因表達調控方式中，作為表觀遺傳重要內容的DNA 甲基化是重要途徑之一(王忠華等, 2013)。目前，很多研究已經證明環境脅迫刺激能夠使生物體通過改變DNA 甲基化狀態從而調控基因的表達以適應新環境(甄艷等, 2018; 高凱倫,2018)。生物外界生存環境條件的改變，不僅可通過DNA 甲基化修飾對生物體本身產生表觀遺傳上的變異，有些DNA 甲基化修飾還可以經遺傳傳遞給后代(Kakutani et al, 1999)，這些環境脅迫誘導的DNA 甲基化修飾通常認為具有可逆或可丟失性，但越來越多的研究證明，有些DNA 甲基化比較穩定并可以延續若干個世代(Kakutani, 2002)，這種現象稱為跨代遺傳，這一特點為DNA 甲基化等表觀遺傳變異在動植物育種上的應用提供了可能。DNA 甲基化在優良性狀新品種的育種工作中，尤其是抗逆性狀的遺傳改良方面具有巨大的應用潛力(Richardson et al , 2006;Schmitz et al, 2013; Ruizgarcia et al, 2005)。

環境脅迫對生物體基因組DNA 甲基化的影響是復雜多向的，DNA 甲基化的變化不僅可以產生有利的表型變異，也可能產生有害的表型變異，而目前進行有益性狀表型的育種還不能通過有目的地改變DNA 甲基化狀態來實現。在本研究刺參的耐高溫品系的育種過程中，對選育群體進行了多次的高溫脅迫淘汰，這種環境脅迫是否通過DNA 甲基化的修飾改變獲得了有利的表型，增強了刺參選育系的耐高溫抗逆性狀，需要探究。現階段利用DNA 甲基化的檢測方法來追蹤檢測刺參育種過程中表觀遺傳的改變，可以為后期更深入利用表觀遺傳修飾來進行抗逆品種的培育和遺傳改良提供理論依據。

3.2 選育群體的遺傳多樣性

MSAP 檢測到條帶分為甲基化敏感位點和非甲基化位點。甲基化敏感位點的多態性是由CCGG 位點的胞嘧啶甲基化變化引起，一般認為，甲基化變異易受環境的誘導(Richards et al, 2010; Schmid et al,2018; 郭萬里, 2006)。本研究中，基于甲基化敏感位點的Shannon 指數，即能夠表示表觀遺傳多樣性的參數，在基礎群體和選育群體中有所改變，可以推測選育群體在高溫脅迫淘汰選育環境下發生了甲基化變異。非甲基化位點變異主要由基因組序列變異引起，可以利用這些序列變異評估群體遺傳多樣性。本研究結果顯示，隨著選育世代的增加，基于非甲基化位點的Shannon 多樣性指數逐漸降低，F＞F1＞F4，說明選育的篩選措施降低了種群的遺傳多樣性，種群的非甲基化位點變異出現隨選育增強的漸變特征。另外，基于甲基化敏感位點計算得到的表觀遺傳多樣性都大于基于非甲基化位點變異得到的遺傳多樣性，在3 個選育相關種群中，表觀變異出現頻率高于傳統遺傳變異，表明在3 個刺參群體中由DNA 甲基化引起的表觀變異更易受外界環境影響。

一般認為，表觀變異比遺傳變異更易受環境影響，環境誘導促進表型變異，從而適應環境(Angers et al, 2010; Guarino et al, 2019; Vaughn et al, 2007)，快速而直接，且體現一定的獨立性，同時，表觀遺傳變異可促進遺傳變異的產生，有助于生物對環境的適應及促進表型上的多樣性(Lewis et al, 2007; 燕雪飛,2014)。本研究中，3 個刺參群體基于甲基化敏感位點和基于非甲基化位點的遺傳距離相關性分析顯示，二者在3 個種群相關性顯著，說明在刺參優良品系的選育過程中，表觀變異在一定程度上與遺傳變異相互依賴和影響。

3.3 選育對甲基化狀態和模式的影響

從刺參選育基礎群體F 和選育F1代、F4代甲基化模式分析結果來看，3 個種群間甲基化模式有較大的不同，其中，F1代與F4代的半甲基化位點和整體甲基化位點比較相近，且二者都表現為半甲基化位點高于各自全甲基化位點。張鵬遠(2012)研究表明，不同的地域環境確實對煙草甲基化狀態產生了影響；周艷華等(2015)研究也表明，茶樹在抗寒響應中出現DNA 甲基化現象，因此，不同刺參群體甲基化模式存在顯著差異，推測是由于選育逆境脅迫適應所致。選育F4代獲得的類型Ⅱ條帶數最多為161 條，明顯高于未選育刺參，這種改變可認為是選育群體由于選育活動獲得的表觀遺傳上的改變。本研究中，不同刺參群體在選育過程中經歷不同的生存環境可能是導致甲基化模式差異的原因。

甲基化狀態和模式數據說明，選育改變了DNA甲基化水平，并對模式產生了影響，刺參選育F1與F4代經過選育后獲得一些甲基化位點的改變，甲基化狀態變化趨勢相近，說明溫度脅迫選育改變了刺參群體的基因組的甲基化狀態。這可能是由于基因組原來的甲基化水平、模式等甲基化狀態受到選育壓力的影響，開啟某些功能基因的轉錄表達等生理代謝過程，致使選育對象產生了適應機制來應對環境脅迫的影響，并且在選育過程中將這種機制傳遞給了后代。在刺參的抗逆耐高溫選育期間，選育材料在脅迫環境響應和適應中，表觀遺傳修飾可能起到很大作用。

4 結論與展望

本研究利用10 對MSAP 引物對3 個刺參選育群體的遺傳多樣性及表觀遺傳多樣性進行分析，從遺傳物質基礎的角度揭示選育群體的遺傳改變與進展，為抗逆新品種選育中的表觀遺傳研究提供了參考。DNA甲基化在水產動物遺傳育種中的研究剛剛起步，但隨著DNA 甲基化分析技術的進步，尤其是隨著新一代大規模測序技術的迅速發展，DNA 甲基化相關研究在群體遺傳關系分析、分子育種、性狀分析及分子標記輔助選擇等方面將發揮重要作用。