水產動物種質創制新技術及在海參、海膽遺傳育種中的應用*

丁 君 韓泠姝 常亞青

(1. 大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點實驗室 大連 116023；2. 寧波大學海洋學院 寧波 315832)

隨著經濟和科技的發展、人口增長對水產品需求的增加以及基礎建設和科研經費的投入，水產養殖行業迅速發展(Bostock et al, 2010; Wang et al, 2017)。截至2019 年，我國水產養殖面積為7.1×106hm2，養殖產量為5079.07 萬t，年養殖產值為9761.89 億元(農業農村部漁業漁政管理局等, 2019)。水產種質資源是我國漁業生產的重要物質基礎和人類重要的食物蛋白源，然而，隨著養殖技術的發展和市場需求的增多，養殖密度不斷增加，棲息地環境惡化、苗種混雜，使現有品種種質退化、生長緩慢、抗逆性降低。因此，種質創制已成為我國水產養殖業研究的重點之一。

“發展養殖，種業先行”是養殖業一條亙古不變的法則。種質創制在水產養殖中發揮著重要的作用，良種培育的突破性成果給水產養殖產業帶來巨大的發展和提高。種質創制新技術是國內外最為活躍的研究領域之一，隨著生物工程技術在水產動物遺傳育種中發揮重要作用，逐步建立了多倍體誘導、雌核發育、性別調控、轉基因等細胞工程育種技術。高通量測序技術的發展及分子標記的批量開發為分子輔助育種及全基因組育種提供了重要的平臺(常亞青等, 2013;張曉娟等, 2019)。本文重點介紹了棘皮動物(海參和海膽)的種質資源概況、水產養殖種質創制新技術的研究進展以及在經濟棘皮動物中的研究現狀，探討了種質創制新技術在水產養殖及經濟棘皮動物中的應用以及未來的發展方向。

1 棘皮動物種質資源概況

海參、海膽分別屬于棘皮動物門海參綱(Holothuroidea)、海膽綱(Echinoidea)，全球有記錄的海參約有1000 多種、海膽約有850 種。海參綱、海膽綱中有較多的經濟物種，2019 年中國海參養殖年產量達到171700 t，海膽養殖年產量已達8243 t (農業農村部漁業漁政管理局等, 2019)。

1.1 海參

海參分布于全球各大洋，主要在熱帶區和溫帶區，絕大多數進行底棲生活。溫帶區海參資源呈單種性，熱帶區海參資源則呈多種性。目前，世界海參產量的86%來自熱帶區，其中，印度洋–西太平洋區是世界上海參種類最多、資源量最大的區域(姜健等,2004; Conand et al, 2010)。中國約有海參120余種，沿海各省均有分布，其中經濟價值較高的有10余種(表1)，主要分布于溫帶區和熱帶區，刺參(Apostichopus japonicus)是最主要的經濟種類。

1.2 海膽

海膽廣泛分布于世界各海域中，營底棲生活。自寒帶至熱帶，從潮間帶的淺水區到水深5000 m 的深海區，均能見到它們的蹤跡。中國已記錄的海膽有8 目26 科60 屬93 種，分布于我國山東、遼寧、浙江、福建和廣東沿海一帶(杜俊義, 2005; Massin et al,2000)。目前，已被較好開發并能形成規模性漁獲量的經濟種類不超過30 種，其中，已開展規模養殖和研究的品種約有7 個(表2)。

表1 我國常見海參的種類、形態特征及分布Tab.1 Species, morphological characteristics and distribution of common sea cucumbers in China

續表1

2 海參、海膽遺傳育種應用基礎與技術研發

水產養殖產量下降與物種近交衰退及病害直接相關，且產量和效益取決于其遺傳資源的利用率。因此，了解水產動物的生物學特性至關重要，許多在產業中影響較大的水產養殖品種，便是在對其遺傳背景充分了解的基礎上培育而成的。刺參具有再生、夏眠、應激排臟、離水后由肛門排水和身體伸縮變形等特殊的生理習性和應激反應；海膽性腺中n-3、n-6 不飽和脂肪酸含量豐富。開展上述海參、海膽特征遺傳性狀基礎解析及其性狀測量技術研發，對海參、海膽種質創制至關重要。

2.1 分子標記開發、遺傳連鎖圖譜構建與全基因組測序

分子標記輔助育種(Molecular marker-assisted breeding, MAS)是借助與性狀緊密相關的分子標記對具有性狀優勢的等位基因或基因型的個體進行直接選擇育種，是分子生物學和基因組學的研究結果應用到水產養殖品種選育的技術(魯翠云等, 2019)。

表2 我國常見海膽的種類、形態特征及分布Tab.2 Species, morphological characteristics and distribution of common sea urchin in China

利用SSR (Simple sequence repeats)分子標記技術，對扇貝“渤海紅”、墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)及其雜交子代3 個群體共90 個個體的遺傳多樣性進行分析，結果可為扇貝“渤海紅”和墨西哥灣扇貝群體種質資源評估和雜交新品種的選育提供理論參考(姚高友等, 2020)。廖梅杰等(2021)利用SSR 指紋圖譜技術對中、韓、俄不同地區刺參群體進行遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建，構建的指紋圖譜可將8 個群體分開，為刺參種質資源保護及不同地理種群刺參的鑒別提供技術支撐。

盧超等(2010)應用微衛星富集文庫——菌落原位雜交的方法，篩選得到33 個刺參的微衛星標記。利用48 個野生刺參個體對33 個微衛星位點進行評價，結果顯示，位點都具有多態性，表明富集文庫—菌落原位雜交法篩選微衛星標記比較高效，獲得的微衛星標記可以用于刺參的分子遺傳學研究。

丁君等(2008)采用磁珠法從中間球海膽基因組中分離富集微衛星DNA，獲得160個陽性克隆和108個微衛星序列，并對其特征進行了分析。在此基礎上，根據微衛星位點的側翼序列，通過篩選，采用其中的12對微衛星DNA標記對大連凌水、大連獐子島、山東榮成3個中間球海膽養殖群體的遺傳多樣性進行了分析。Yan等(2010)也分離并鑒定了61個海膽微衛星標記，所開發的多態性標記已用于選擇育種親本的選擇。

QTL 輔助育種是通過遺傳標記與性狀之間的相關性分析，將一個或多個QTL 定位到染色體的遺傳標記之間，并據此標記進行分子標記輔助育種的方法，其基礎是高密度遺傳連鎖圖譜。

在遺傳連鎖圖譜構建方面，Li等(2009)選擇37個擴增片段長度多態性(AFLP)引物組合，確定了刺參親本484個多態性標記，生成的圖譜將作為構建高分辨率遺傳圖譜以及繪制功能基因和定量性狀基因座的基礎，為刺參應用標記輔助選擇育種策略開辟道路。Yan等(2013)基于刺參2個F1家族微衛星和SNP標記構建了刺參的共有遺傳圖譜，雄性連鎖圖包括157個基因座，跨度為1244.9 cM，而雌性連鎖圖包括153個基因座，跨度為1399.1 cM，共有圖譜中鑒定出22個連鎖群，與刺參的單倍體染色體數一致。劉安然等(2019)利用已構建的刺參高密度遺傳連鎖圖譜，初步定位了體長、體寬、體重、棘刺總數和存活天數(抗病力)5個性狀相關的9個QTL區域，獲得81個SLAF標簽。Tian 等(2015)采 用2b 限 制 性 位 點 相 關 的DNA 測 序(2b-RAD)方法構建了共有7839個標記，覆蓋率達到99.57%的高密度、高分辨率的海參遺傳圖譜(這是棘皮動物中最高的標記密度)，QTL作圖和關聯分析一致捕獲了一個位于連鎖群(LG)5的5 cM區域的與生長相關的QTL，結果表明，涉及精細QTL定位和標記輔助選擇(MAS)的強大研究工具將促進染色體分配并改善海參的全基因組裝配。

Zhou 等(2015)構建了光棘球海膽和中間球海膽2 種海膽的遺傳圖譜，為后續開展QTL 分析和群體遺傳學研究提供了便利。Chang 等(2018)構建了包含21 個連鎖群的中間球海膽的高密度遺傳圖，檢測到33 個潛在的QTL，并據此開發了與中間球海膽生長性狀、性腺性狀相關的KASP 標記，已應用于新品種開發。

近年來，隨著大規模測序成本不斷降低，海膽、海參全基因組測序相繼完成，為全基因組選擇育種技術的研發提供了保證。2006 年11 月9 日，休斯敦貝勒醫學院(Baylor College of Medicine, BCMHGSC)人類基因組測序中心宣布完成對紫球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)基因組測序，其序列長約為814 Mb，編碼約23300 個基因，此后，綠海膽(Lytechinus variegatus)、馬糞海膽的基因組序列也分別于2016 年、2018 年被報道(Erica et al, 2006; Sergiev et al, 2016; Kinjo et al, 2018)。自2012 年起，中國學者相繼破譯了數十種水產養殖生物的全基因組序列。Zhang 等(2017)和Li 等(2018)完成了刺參全基因組測序，構建了刺參全基因組的精細圖譜，基因組組裝全長為800～950 Mb，編碼約29000～30350 個基因，助推了刺參重要經濟性狀解析、全基因組選擇育種和分子標記育種。

2.2 經濟性狀評測

育種目標的選擇、育種方案的制定與經濟性狀評測技術的發展緊密相關，畜禽動物均有較為成熟、系統的經濟性狀(生產性狀)評測體系。而水產動物由于種類眾多、習性各異，除魚類外，還沒有建立起較為完備的經濟性狀評測指標體系；近年來，由于水產動物育種目標從單純的生長性狀育種向品質、抗逆育種的轉變，水產動物經濟性狀測評和指標體系建立的工作任務更加艱巨。由于海參、海膽年齡確定困難、應激排臟、離水后吐水和身體伸縮變形等特點，其性狀測量更為困難。目前，開展的相關工作有Chang 等(2012)通過對刺參野生、養殖、雜交3 個群體的鮮活、水煮和干燥標本進行研究，首次建立了準確測定刺參鮮活、水煮以及干燥狀態下，刺參棘刺數目的估算標準，即P/L≥0.05(P：棘刺長度；L：體長)；魏杰等(2007)開發了一種能準確測量活體刺參體長的方法，即利用濃度為0.5～0.6 mol/L 的MgSO4溶液浸泡海參1.5～2 h使之達到不化皮、不吐腸的穩定狀態后，可測得活體刺參自然伸長的長度，且微流水刺激5～6 h 后，海參即可恢復正常運動、攝食。

近年來，近紅外光譜(Near infrared spectroscopy,NIR)被廣泛應用于水產品多糖、蛋白質、脂肪、鋅、硒和灰分等成分檢測當中。相較于其他水產品快速檢測方法，NIR 技術有重現性好、效率高、成本低、測試簡單、分析快速、樣品無破壞性等特點；分析過程無污染，對測試人員要求不高，可在線檢測等優點(藍蔚青等, 2017)。目前，近紅外光譜技術逐漸成為應用廣泛的無損快速檢測技術之一，已被應用在棘皮動物的品質鑒定中。王衛軍等(2015)以94 份具有代表性的長牡蠣(Crassostrea g igas)鮮樣組織樣本的近紅外數據和其對應的化學真實值數據為基礎，研究了NIR 技術預測長牡蠣鮮樣組織中水分、糖原、總蛋白質、總脂肪、鋅、硒、牛磺酸和灰分8 種成分含量的可行性。李尚俊(2017)利用便攜式近紅外光譜儀和傅里葉變換式近紅外光譜儀分別對刺參多糖、蛋白質、脂肪、灰分、皂苷、鋅和硒7 種肉質品質成分進行測量及建模。結果顯示，根據各參數指標判斷便攜式近紅外光譜儀掃描的光譜測量結果，多糖和蛋白質建模可行，各決定系數(R2)均大于0.8，驗證集標準差與預測標準差之比(RPD)分別為2.67 和2.99，灰分各R2均大于等于0.9，RPD=3.21>3，表明模型建立良好，可進行含量預測。傅里葉變換式近紅外光譜儀對相同樣品進行掃描、建模，結果表明，蛋白質各R2均大于0.85，RPD=2.80，建模可行，但需要進一步的優化，灰分各R2均大于0.9，RPD=3.26>3，建模效果良好。

當前，代謝組研究為解析水產動物重要經濟性狀遺傳機制提供了有力工具，在代謝物分子遺傳參數估計、不同品種(系)的生物標記篩選、代謝分子全基因組關聯分析研究(Genome-wide association studies with metaotypes, mGWAS)以及尋找代謝分子與重要經濟性狀的關系等方面發揮著重要作用。Zhao 等(2020)采用超高效液相色譜質譜分析(UPLCQ-TOF/MS)對遼寧大連、皮口、錦州和山東乳山不同產地海參的體壁代謝物進行了分析，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和KEGG 代謝途徑分析方法，對不同地理來源的海參的代謝產物進行了評價。結果表明，OPLS-DA 對這4 個區域海參的體壁代謝物有明顯的鑒別作用，差異代謝物主要包括氨基酸和脂類，而KEGG 代謝途徑結果分析表明，脂質代謝、氨基酸代謝和蛋白質代謝與地理來源密切相關。

2.3 經濟性狀遺傳參數測定

遺傳參數如遺傳力、重復力、遺傳相關、近交系數、親緣關系等可以反映群體的總體遺傳特征。科學合理地利用統計學可準確估計不同遺傳背景下重要經濟性狀的遺傳參數，在育種中具有重要的指導作用。

在棘皮動物當中也早已開展遺傳參數估計，刺參耳狀幼體(初耳、中耳)時期、幼參、成參的生長性狀以及刺參重要經濟性狀已有相關遺傳力估計的研究。欒生等(2006)基于全同胞組內相關法估計刺參耳狀幼體初、中期體長的遺傳力。結果顯示，基于刺參耳狀幼體體長的加性遺傳方差較大，父系半同胞組內相關法計算的狹義遺傳力是刺參耳狀幼體初、中期體長狹義遺傳力的無偏估計值，估計值分別為0.74 和0.75。和飛(2016)應用數量遺傳學分析和全同胞組內相關法估計了刺參9 月齡體長、體重和棘刺總數這3 個生長性狀的遺傳力。結果顯示，9 月齡刺參體長雌性組分、雄性組分和全同胞組分遺傳力估計值分別為0.87、0.8和0.86；刺參體重雌性組分、雄性組分和全同胞組分遺傳力的估計值分別為0.20、0.73 和0.46；棘刺總數雌性組分和雄性組分遺傳力的估計值分別為0.43 和0.32。李云峰等(2009)對刺參中耳幼體的27 個全同胞和稚參階段的23 個全同胞幼刺參的體長分別進行測量，中耳幼體階段共測量81 個個體，稚參階段共測量640 個個體，并用MTDFREML 軟件中的混合動物模型對其進行分析，估計刺參早期生長發育的遺傳力。結果顯示，刺參中耳幼體階段的體長生長性狀遺傳力為0.29，稚參階段的體長遺傳力為0.49，在刺參的不同發育階段其體長生長性狀的遺傳力屬于中度遺傳力范圍，說明刺參的體長生長性狀是在加性效應控制下，對刺參進行選擇育種具有較大的遺傳改良潛力。

海膽幼體、稚海膽及成體生長性狀的遺傳參數估計(韓奮杰等, 2017; 劉小林等, 2003)及對海膽重要經濟性狀性腺品質的遺傳參數估計已被報道(Zhao et al,2014)。劉小林等(2003)測定蝦夷馬糞海膽每個母系孵化后3 月齡和5 月齡的全同胞幼海膽(40～50 個)后代的體重和殼徑，應用數量遺傳學原理和半同胞組內相關分析法研究蝦夷馬糞海膽早期生長發育性狀的遺傳力。結果顯示，3 月齡和5 月齡海膽體重和殼徑的狹義遺傳力估計值分別為0.339～0.523 和0.316～0.487。分析結果顯示，雌性遺傳方差組分均顯著大于雄性遺傳方差組分，雌性遺傳方差組分存在顯著的母性效應，表明由雄性遺傳方差組分估計的遺傳力準確可靠，父系半同胞組內相關法計算的狹義遺傳力是遺傳力的無偏估計值，為海膽選擇育種提供了理論指導。Chang 等(2012)構建中間球海膽的選擇家系，估計其生長性狀和性腺性狀的遺傳參數(殼高為0.24～0.39，殼徑為0.21～0.48，體重為0.16～0.49，收獲期性腺濕重、性腺指數和性腺含水量的遺傳力分別為0.17、0.41 和0.50)，發現各主要性狀具備中度到高度的遺傳力，為中間球海膽選擇育種提供了理論指導。韓奮杰等(2017)采用巢式不平衡設計方法，建立了44 個中間球海膽全同胞家系，用于估計中間球海膽幼體及稚海膽生長性狀的遺傳參數，采用動物模型和約束性最大似然法(REML)估計中間球海膽幼體和稚海膽生長性狀的遺傳參數。結果顯示，中間球海膽四腕幼體和八腕幼體體長的遺傳力分別為0.705±0.373和0.538±0.444，為高度遺傳力；六腕幼體體長和稚海膽殼徑的遺傳力分別為(4.31×10–7)±(3.53×10–8)和(2.97×10–7)±(2.38×10–8)，均接近于 0，為低度遺傳力。因此，在四腕幼體和八腕幼體時期，幼體體長具有更好的選育潛力，而應避免選擇六腕幼體和稚海膽時期。

目前，遺傳參數估計可以應用分子標記數據進行估計，本項目組(大連海洋大學和中國海洋大學團隊)對不同地理刺參群體的疣足數量進行重測序全基因組水平的SNP 遺傳力估計，運用期望最大約束似然法(EM-REML)、平均信息約束似然法(AI-REML)對刺參疣足數量的 SNP 遺傳力進行評估。結果顯示，MAF>0.05 時，在50 K SNP 基礎上均勻抽樣不同SNP密度的刺參疣足數量，SNP 遺傳力估計均值范圍為(0.566±0.022)～(0.612±0.003)；MAF>0.1 時，SNP 遺傳力估計均值范圍為(0.586±0.015)～(0.615±0.016)。

3 水產動物育種技術及其在經濟棘皮動物中的應用

目前，雜交育種和選擇育種等傳統育種技術在海參、海膽新品種培育中仍占主導地位，隨著現代遺傳育種理論和生物技術的不斷發展和創新，全基因組選擇育種、基因編輯等前沿技術也有嘗試和應用，在今后一段時間內，海參、海膽育種將在傳統育種技術的基礎上，以現代育種技術為補充，逐步提高育種效率，實現精準育種。

3.1 雜交育種與雜交優勢利用

雜種優勢是普遍存在的一種重要生物學現象，對改良生物的生產性能有重要作用(張國范等, 2004)。第1 次記載的雜交育種出現于1760 年(Xu, 2010)。

在海參方面，農業農村部審定通過的我國海參養殖的第1個新品種刺參“水院1號”，其父本為俄羅斯遠東海參，母本為遼寧大連海域刺參，經過近10年“優中選優”培育而成。該品種有6排棘刺，具有體大、出皮率高、營養價值高、苗種成活率高和生長速度快等優點(Chang et al, 2012)。此外，我國刺參與其他國家的刺參在雜交育種過程中，其苗種在生長、存活率及幼體生長速率等方面均表現出明顯的雜種優勢(胡美燕, 2009; 孫靈毅等, 2013)。

在海膽方面，丁君(2009)對中國北方地區幾種經濟海膽的種間雜交和雌核發育進行了研究。雜交子一代在成體生長發育的各項指標中(殼徑、殼高、體重、性腺重和性腺指數)均體現出雜種優勢，如蝦夷馬糞海膽×光棘球海膽組所有性狀的雜種優勢率均為正值，范圍為0.32～2.49，蝦夷馬糞海膽×紫海膽組的雜種優勢率在殼徑、殼高、濕重、性腺重和性腺指數方面均為正值，雜交優勢率為4.00%～49.40%，具有在生產中應用的潛力。Rahman 等(2005)研究表明，雜種F1代性腺產量比中親本提高45%。

在海參、海膽南方群體與北方群體的雜交中，獲得耐高溫、品質優新品種，是海參、海膽雜交育種的新方向，但其后代的育性是其需要考慮的重要因素。

3.2 選擇育種

選擇是育種的基礎，自20 世紀70～80 年代起，群體選育和家系選育已廣泛應用于水產生物的遺傳育種。1996～2020 年農業農村部審定的243 個水產新品種中，有67 個選育品種是通過群體或家系選育培育而成的。在選擇育種技術發展過程中，Henderson(1975)提出的最佳線性無偏預測，因其能對系統環境誤差進行矯正，得到無偏可穩定遺傳的育種值，在20 世紀90 年代開始應用于水產生物遺傳育種，特別是對蝦和貝類的遺傳育種中廣泛應用(常亞青等,2013)。

孫效文等(2009)研究認為，開展DNA水平的標記輔助育種是科學發展的必然，既包括育種技術的發展，從統計學分析，DNA提供的多位點選擇明顯優于表型性狀提供的少數位點；又包括基因標記，它是性狀的遺傳基礎，從基因或基因組與性狀的關系獲得的標記是用于選擇優良性狀最根本的工具。2009年至今，基因標記已運用到我國大多數水產養殖動物的種質鑒定和品種選育研究中，取得了較大進步。董玉等(2016)應用一般線性模型對46個SNP標記與刺參體重、體長、體寬、體壁重和出肉率性狀進行關聯研究發現，8個SNP基因型BB與這些生長性狀顯著相關，推測基因型BB是這些位點的優勢基因型。趙歡等(2014)測定定向選育獲得的刺參耐高溫子一代在高溫下的存活率及熱休克蛋白基因表達，從一定程度上驗證了高溫耐受性的可遺傳性，為后續刺參良種培育提供了理論基礎。隨著生物技術的快速發展以及測序價格的急劇下降，分子標記技術得到快速發展和應用(魯翠云等, 2019)。

利用選擇育種的方法，我國先后育成了刺參“崆峒島1號”、“安源1號”、“參優1號”、“東科1號”、“魯海1號”等國家審定經濟棘皮動物新品種。其中，“參優1號”以抗燦爛弧菌(Vibrio spl endidus)侵染能力和生長速度作為選育性狀，利用群體選育方法構建刺參抗逆選育系，并采用抗病分子標記篩選與驗證、抗病功能基因篩選與驗證等分子標記輔助選育技術，連續4代培育而成。“參優1號”在6月齡時，燦爛弧菌侵染后成活率提高了11.68%，顯著提高抗化皮病的能力；生長速度快，池塘養殖收獲時的平均體重相比未經選育群體提高了38.75% (丁君等, 2020)。

在海膽方面，我國以大連旅順、大連凌水和山東榮成3個中間球海膽養殖群體構建基礎群體，以體重、殼徑和生殖腺顏色為選育指標，采用群體選育輔以家系選育技術，經連續4代選育，培育出中間球海膽新品種“大金”。在相同養殖條件下，與未經選育的中間球海膽相比，26月齡平均體重和殼徑分別提高31.7%和10.4%，生殖腺飽滿、色澤金光(丁君等,2020)。

在基因組選擇育種方面，Meuwissen 等(2007)基于分子標記輔助育種提出全基因組水平的選擇育種技術。目前，水產動物全基因組選擇育種技術處于形成發展期，通過搭建貝類全基因組選擇育種分析評估系統(Jiao et al, 2014; Li et al, 2015)，培育出新品種櫛孔扇貝(Chlamys fa rreri)“蓬萊紅2 號”、海灣扇貝(Argopectehs irradias)“海益豐12”。李富花等(2020)發明了一種提高水產動物全基因組選擇育種效率的方法，即通過SNP 分型和表型數據進行GWAS 分析，獲得每個SNP 的P 值并按從大到小的排序，選擇排序靠前的最優標記組合對育種群體和下一代育種群體進行SNP 分型，通過GBLUP、BayesB、ssGBLUP等方法預測基因組育種值，并從高到低進行個體選擇，此方法應用于對蝦體重性狀和大西洋鮭(Salmo salar)抗病性狀的全基因組選擇分析，發現最優標記組合能顯著提高全基因組選擇的準確率。

新品種的培育將會給水產產業帶來巨大的社會效益和經濟效益，隨著水產育種新技術的開發與應用，海參、海膽選擇育種將向著多種方式有機融合的方向發展。

3.3 細胞工程育種技術

細胞工程育種是當今生命科學最前沿的生物技術之一。細胞工程是在細胞水平上進行遺傳操作與加工，定向改變或創造新的物種，或創造具有新遺傳特征細胞的技術(陳立僑, 1997)。細胞工程育種技術包括核移植(核質雜交)、雌(雄)核發育和多倍體育種技術等。

多倍體育種技術是通過增加染色體組的方法來改造生物的遺傳基礎，培育出符合人們需要的優良品種，養殖實踐發現，人工多倍體水產動物通常具有生長速度快、個體大、抗逆性強、不造成種質資源污染的特點，已在生產中廣泛應用。目前，多倍體水產動物育種工作(即細胞工程育種)仍是水產經濟動物種質改良的重要途徑和研究熱點(宋燦等, 2012)，該技術在魚類和貝類中研究較多，而針對棘皮動物的研究較少。劉筠等(2003)培育出三倍體“湘云鯽”和“湘云鯉”新品種。闕華勇等(2005)培育出牡蠣四倍體。武祥偉等(2019)研究表明，通過四倍體與二倍體雜交產生的三倍體牡蠣生長性狀優勢明顯、糖原含量豐富，并在美國和中國進行商業化生產，現已占據美國市場的70%。

藥物誘導和靜水壓誘導多倍體技術已運用于刺參和海膽，并取得了成功。常亞青等(2002)和Ding等(2007)研究發現，CB 與6-DMAP 均可誘導刺參產生三倍體和四倍體，采用CB 抑制PBI 誘導，到達小耳幼體時，可產生9.7%～21.3%的四倍體；6-DMAP抑制PBI 誘導三倍體，三倍體誘導率介于7.5%～58%之間。此外，常亞青等(2005)首次將靜水壓誘導多倍體技術運用在刺參上，并取得了成功。丁君等(2019)優化了靜水壓誘導刺參三倍體條件，刺參囊胚期三倍化率達到80%以上。

在海膽多倍體誘導方面，常亞青等(2008)已將靜水壓誘導多倍體技術運用在海膽上，已經成功獲得了中間球海膽四倍體胚胎及發育至四腕時期的幼體，于16℃水溫下，提前染色分離時間為12 min，60 MPa下靜水壓處理9 min 的最佳誘導條件下，獲得四倍體胚胎，取得91.5%的平均倍化率。研究發現，與二倍體比較，四倍體發育時間顯著較慢，各期幼體的個體均顯著較小，在發育至四腕幼體時，四倍體死亡率高達50%以上，發育至六腕幼體時，四倍體全部死亡，存活率顯著低于二倍體。

在海膽雌核發育研究方面，丁君等(2004)采用不同劑量(30～330 mJ/cm2)的紫外線對中間球海膽精子進行照射失活，獲得了雌核發育的單倍體胚胎，受精卵早期和早期囊胚的單倍體率分別達98.2%和70%，但后續研究顯示，照射組受精卵發育至破膜囊胚后，出現了大量畸形，27 h 后死亡率達98%。這可能是由于水產動物中存在較多的隱性致死或有害基因，因而誘發的雌核發育二倍體存活率很低，同時，經紫外線照射的精子本身雖不能參與細胞分裂，但精核仍殘留在卵內，對卵的正常發育產生不利的影響，從而使胚胎生存率降低。曹學彬等(2008)采用紫外線照射使馬糞海膽精子遺傳失活，用熱休克抑制第1 次卵裂獲得雌核發育二倍體。結果表明，熱休克法抑制第1 次卵裂不僅降低了胚胎的畸形率，還提高了胚胎上浮率。

目前在核移植方面，魚類的研究最為成功(童第周等, 1963)。而針對棘皮動物的核移植技術運用未有報導，具有極大研究空間。

3.4 基于全基因組信息及分子設計等前沿育種技術

3.4.1 全基因組關聯分析 GWAS 先對研究對象SNP 標記進行檢測，獲得基因型，進而將基因型與表型性狀進行群體水平統計分析，根據顯著性P 值篩選出與目標性狀相關聯的候選基因或基因區域(Gajardo et al, 2015)。GWAS 要比傳統QTL 法有優勢，其具有較高的復雜性狀相關基因定位效率。近年來，這種方法在動植物重要經濟性狀主效基因的篩查和鑒定中得到了廣泛應用(Carole et al , 2008; Charlier et al ,2016)。

與植物、脊椎動物相比較，水產動物的GWAS研究起步相對較晚，關于GWAS 應用的報道較少。Sodeland 等(2013)應用GWAS 技術對大西洋鮭魚肉脂肪含量和硬度進行分析。結果發現，影響脂肪含量遺傳變異的染色體是9 號和10 號，影響魚肉硬度遺傳變異的染色體是3 號和11 號。Shi 等(2020)利用QTL定位和GWAS 對太平洋牡蠣(Crassostrea gi gas)營養成分分析，確定了5 個參與脂肪酸代謝的基因，并深入挖掘到了6 個與肉品質相關的基因，為后續選擇育種提供了資源。Wang 等(2020)通過GWAS 鑒定了與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)生長相關的SNP，并發現了1 個調節生長的新基因LvMMD2。

目前，大連海洋大學與中國海洋大學正聯合開展水產動物GWAS 研究。雖然，GWAS 技術已經應用到水產育種工作中，但大部分研究還停留在尋找與目的性狀相關的SNPs 位點/候選區間/候選基因上，只有極少數研究對所獲得的目的基因進行過實驗驗證。在后續的研究中，更多經濟水產動物的全基因組測序將完成，在已完成基礎群體構建、遺傳力等參數固定的情況下，擴大選育群體的規模并結合重測序開展GWAS 分析，可能是未來經濟棘皮物種遺傳育種的主要途徑之一。

3.4.2 基因編輯 基因編輯是在基因組水平對基因片段進行插入、敲除、替換或修飾等，能高效、定向地編輯目的基因。主要方法有鋅指蛋白核酸酶技術(Zinc-finger nuclease, ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術(Transcription activator-like effector,TALENs) 和CRISPR/Cas9 技 術(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease)等。基因編輯技術作為現下最熱門的研究領域之一，在水產養殖業中得到快速發展。Doyon等(2008)首次利用ZFN技術在斑馬魚(Danio reri o)中進行基因敲除，得到了ntl、slc24a5、kdrl基因的突變體，構建了斑馬魚的基因敲除品系。Hwang等(2013)利用CRISPR技術實現了對斑馬魚fh基因的敲除；周運迪等(2019)利用CRISPR技術建立了青鳉(Oryzias la tipes)foxl2基因缺失的突變體，表明foxl2對維持青鳉性腺功能有重要作用。迄今，CRISPR技術已在許多水產養殖物種中建立了應用，如牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大型溞(Daphnia mag na)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)、太平洋牡蠣、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)等(Kim et al,2019; Nakanishi et al, 2014; Gui et al, 2016; Yu et al,2019; Sasaki et al, 2014; Nymark et al, 2016)。

CRISPR 技術也應用于模式生物海膽中。Lin 等(2017)將CRISPR/Cas9 系統應用于海膽胚胎，針對Nodal 基因設計了6 個引導RNA (gRNA)，發現其中5 個gRNA 在60%～80%的注射胚胎中誘導了預期的表型，同時，還開發了1 種從單個胚胎中分離基因組DNA 的簡單方法。Liu 等(2019)通過CRISPR/Cas9 系統，敲除海膽中的Pks1 基因，成功誘導出白化病海膽成體，并存活 1 年。這些研究成果有望加快CRISPR/Cas9 系統在海膽胚胎基因組編輯和分子育種中的應用。

隨著海洋生物基因組研究的快速發展，CRISPR技術也為海洋生物，特別是水產養殖領域的研究帶來了前所未有的機遇，今后可重點在提高繁育效率、生長速度、抗逆性和抗病性等方面開展。

3.4.3 基因轉移與轉基因技術 轉基因技術主要是將外源基因或體外重組基因轉移到受精卵中，使其在動物體內整合和表達，產生具有新的遺傳特征或性狀的動物。將外源基因導入的方法有很多種，如基因槍法、顯微注射法、電穿孔法、精子介導基因轉移法、化學誘導法和病毒轉染法等。

轉基因技術在水產中的應用多見于轉基因魚，Zhu 等(1985)首次獲得了轉基因金魚，隨后率先在世界上開展了魚類生長激素轉移研究，獲得了生長快、產量高的“超級魚”，建立了世界上首例轉基因魚模型(Zhu et al, 1986; 朱作言等, 1989; 崔宗斌等, 1995)。轉生長激素魚促生長效應明顯，可望為水產養殖業帶來巨大的經濟效益。國內外也有很多學者聚焦于抗性基因的轉移，提高魚類抗寒和抗病性等，使魚類更好的適應環境，在逆境中生長(Assem et al, 2005; Gong et al, 2001、2002; Blake et al, 2016)。

轉基因技術在無脊椎動物中的應用越來越多，同樣集中在提高生長速度和抗逆性方面。在蝦蟹和貝類方面，劉萍等(1996)將生長激素基因導入中國對蝦(Fenneropenaeus chi nensis)受精卵中，獲得了轉基因蝦。劉志毅(2000)首次采用基因槍法將GFP 基因轉入中國對蝦受精卵中并表達。Piera 等(2004)分別采用顯微注射、電穿孔和轉染試劑3 種方法將外源基因轉入凡納濱對蝦中，發現用DNA/jetPEI 復合物轉染處理效率最高。劉向宇等(2000)以精子為載體將GCHV(Hemor rhagic virus of grass carp)基因導入中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)，作為蟹類轉基因的初步研究。Powers 等(1995)首次將生長激素基因轉入紅鮑(Haliotis rufescens)中，打開了貝類轉基因的研究大門。隨后又將外源基因導入了白蛤(Mulina la teralis)、太平洋牡蠣、大珍珠母貝(Pinctada maxima)、合浦珠母貝(Pteria martensii)等貝類中并得到了表達(Lu et al , 1996;Cadoret et al, 1997; 胡煒等, 2000; 喻達輝等, 2005)。

McMahon 等(1985)首次利用顯微注射法將構建的氨基糖苷3′磷酸轉移酶的DNA 序列連接到載體，構建piSA 質粒，并導入紫海膽卵細胞，進行體外受精培育，發現外源基因在海膽整個胚胎發育時期均有表達，此研究在海膽胚胎轉基因技術研究領域邁出了第1 步，為后續海膽轉基因的深入研究提供了方法和技術參考。海膽作為模式生物，通過轉基因技術，可將報告基因轉入海膽幼體中，進而闡明特定基因的轉錄過程，構建基因調控網絡(Rast, 2000; Buckley et al,2018)。目前，轉基因技術在海參、海膽育種中還未有成功報道。

3.4.4 性別控制技術 自然界中有很多物種的雌雄個體間的形態、顏色或行為等方面存在顯著差異，呈現出“性別二態性”。大量研究發現，尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、斑點叉尾(Ictalurus punct atus)等品種雄魚的生長速度顯著快于雌魚(Beardmore et al, 2001; Wang et al,2010; Simco et al, 1989)；鯉魚(Cyprinus carpio)、虹鱒(Oncorhynchus m ykiss)、牙鲆、圓斑星鰈(Verasper variegatus)等魚類的雌性個體比雄性大(陳松林, 2013;Bye et al, 1986; Yoneda et al, 2007; Ma et al, 2010)；對蝦的性別二態性明顯，成年雌蝦體重明顯大于雄蝦(張乃禹, 1985)。通過對生物性別控制，可加快育種進程，培育單性品種，提高經濟效益。性別控制技術是指在動物正常繁育生殖過程中，通過人為干預，控制成年的雌性動物下一代性別的生物技術。性別控制育種在魚類等水產養殖動物中應用廣泛，主要技術方法包括種間雜交、人工誘導雌(雄)核發育、三倍體誘導不育群體、外源激素刺激和溫度控制。

目前，性別控制技術已經廣泛應用于生產中，由于海參、海膽不存在性別二態性，因此，刺參、海膽性別控制技術報道較少。但在種參培育過程中，雌參的需求量大于雄參，如提前預知種參的性別，則可節約育種成本。陳廷等(2020a、b)報道了鑒別糙海參卵巢發育期雌參個體的方法，研究了小疣刺參促排卵短肽及其編碼基因與應用。Pereira 等(2018)通過基因組和微衛星分析，在Hgr15607 基因座上，觀察到雌、雄刺參頻率分布差異。Láruson 等(2018)通過對雌、雄白棘三列海膽(Tripneustes gratilla)組織表達譜分析發現，Sox 家族在雌、雄海膽中表達有差異，其中，雄性中的SoxH 基因表達顯著高于雌性，在哺乳動物中，SoxH 也參與了雄性生殖細胞的分化。同時發現，Wnt-4 基因僅在雄性海膽中存在，也參與了哺乳動物發育早期雄性化的抑制，在幼體和成體中被恢復，因此推斷，Wnt-4 基因在海膽中可能沒有抑制雄性化的作用，只是在雄性性腺中發揮作用。

4 展望

進入21 世紀后，水產養殖對世界水產品供應的重要性已在發達國家達成共識，海參和海膽是重要的水產養殖動物，刺參養殖是遼寧省和山東省水產養殖的支柱產業。如何保證刺參和海膽等海珍品產業高效、健康發展，是應對新時代水產養殖大變革需要回答的問題。以下是對刺參和海膽養殖業的幾點思考和建議：

4.1 高度重視海參、海膽種質資源保護

水產種質資源是良種創制、增養殖生產和漁業科技發展的物質基礎。目前，世界范圍內現存棘皮類動物6000 余種，我國約有500 余種，其中，種質資源開發利用存在諸多問題，如已被開發利用的海參不足20 種、海膽6～8 種，已開展種質評價的種類不足10 種；目前，棘皮動物中僅有刺參、中間球海膽可進行規模化全人工養殖；藥用棘皮類動物具有較大市場需求，但開發利用不足；我國南海暖水性海參和海膽資源豐富，但目前尚沒有確切分布名錄，且近幾年種類和數量呈較快下降趨勢，其中，海參已被世界自然保護聯盟收入瀕危物種紅色名錄；此外，無序的刺參、海膽苗種交流使現有品種(系)種質退化、生長速度下降，抗逆性降低。針對上述情況，應加強海參、海膽種質資源分布、鑒定、評價、種質保存工作，特別是原種場和良種場建設亟待加強，為海參、海膽種質創新提供物質保障。

4.2 加速海參、海膽遺傳育種應用基礎研究

近10 年來，海參、海膽遺傳育種應用基礎取得長足進步，刺參、海膽全基因組測序和高密度遺傳連鎖圖譜的完成，為下一步全基因組關聯分析和分子標記輔助育種(QTL 定位)奠定了基礎。但較魚、蝦、貝等而言，刺參、海膽遺傳育種應用基礎研究依舊薄弱，下一步工作將重點解析海參、海膽重要經濟性狀的遺傳基礎，挖掘其中與經濟性狀相關的分子遺傳標記、功能基因、調控原件和優異等位基因變異等，并將鑒定出的有育種價值的功能基因和遺傳標記，應用于育種。

4.3 “引種制宜”，創新、集成海參、海膽育種技術(模式)

作為被廣泛認知的海珍品，海參、海膽育種目標應不僅局限在生長性狀，重點應考慮海參膠原蛋白、酸性粘多糖、皂甙，海膽高不飽和脂肪酸含量等品質性狀。同時，應對近年來北方夏季頻發的極端天氣以及隨之而來的海參、海膽病害頻發，應關注海參、海膽耐高溫、耐低鹽以及抗病品種的研發。在育種技術選擇方面，針對海參、海膽的繁殖習性和養殖特點，規模化群選結合分子標記輔助育種是目前海參、海膽效率較高的育種方式。概括而言，在育種過程中要“因種制宜”，在傳統育種技術基礎上，創新、集成育種技術(模式)，并研發新品種、規模化繁育和配套養殖技術，培育出滿足市場需求、有顯示度的海參、海膽優良品種。

4.4 推進海參、海膽種業“育繁推一體化建設”

海參、海膽種業的發展必然要依托“育繁推一體化”建設。這就要求海參、海膽種業相關機構有研發和生產新品種的能力，有向市場推廣銷售的能力。下一步，產學研單位將通過加強國際、國內交流合作，加強種業信息服務平臺建設，推進物聯網技術應用，加大種業企業品種、品牌宣傳力度，有序推進海參、海膽種業“育繁推一體化建設”。