滸苔多糖對非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝及多器官H2S生成的影響

李藝昕，趙愛利，郭福川

(1.福建醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 實驗中心，福建 福州 350122； 2.福建醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，福建 福州 350122)

隨生活方式和飲食習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率逐年增加，是慢性肝病的主要病因之一[1]，以肝臟中脂肪異常蓄積、肝細胞產(chǎn)生脂肪變?yōu)樘卣鱗2]。降低血脂水平可以延緩NAFLD的進展。

滸苔(Enteromorphaprolifera，E.prolifera)是一種藥食兩用的大型經(jīng)濟類海洋綠藻，廣泛存在于我國東南部沿海潮間帶[3]。研究表明藻類硫酸多糖具有多種生物活性[4]。滸苔多糖(Enteromorpha polysaccharide，EP)是從滸苔中提取得到的一種硫酸多糖，具有抗氧化[5]、降血糖[6]、降血脂[7]等多種功效。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認為是第三種氣體信號分子[8]，不僅可預(yù)防缺血再灌注損傷和心力衰竭[9]，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[10]，在肝臟生理和病理生理中也起著重要作用[11]。肝臟中甘油三酯(triglyceride，TG)的生成增加和/或清除降低可導(dǎo)致高甘油三酯血癥，研究顯示，高甘油三酯血癥患者的血清H2S水平低于正常對照人群[12]。另有研究報道，NaHS(H2S的供體)干預(yù)可顯著降低高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠血清TG水平[13]。

在哺乳動物中，內(nèi)源性H2S主要通過特殊酶催化反應(yīng)生成[8]：以同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)為底物，在胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β- synthase，CBS)的催化作用下，代謝成L-型半胱氨酸和H2S，隨后，生成的L-型半胱氨酸在CBS、CSE的催化下進一步代謝生成H2S。

本課題組前期研究中觀察到EP可增加H2S生成，降低血清及肝臟TG水平[14]，但EP誘導(dǎo)H2S生成的機制仍不明確。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD大鼠模型，并采用EP進行預(yù)防性干預(yù)，探討EP對大鼠肝臟脂質(zhì)代謝、血清H2S水平以及多器官CBS/CSE酶活性和蛋白的表達的影響。

1 材料和方法

1.1 多糖的分離純化

采用水萃取-乙醇沉淀法分離提純出EP[6]。參照林勇[15]采用苯酚-硫酸法測得滸苔多糖的含量為62.66%，硫酸鋇比濁法測得滸苔多糖硫酸根含量為16.42%。

1.2 動物實驗

雌性SD大鼠(7周齡，體重180～200 g)由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(閩)2016-0002]。飼養(yǎng)條件：溫度(22±1)℃、濕度(50%～60%)、12 h/12 h晝夜節(jié)律。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將大鼠隨機分為5組(n=10)：空白對照組(Control group, Normal diet+H2O，ig)、EP對照組(EP control group, Normal diet+EP，ig)、模型組(Model group，High-fat diet+H2O，ig)、EP干預(yù)組(EP intervention group, High-fat diet+EP，ig)和硫氫化鈉組(NaHS group，High-fat diet+NaHS，ip)。空白對照組、EP對照組喂食正常飼料(Normal diet)，另外三組喂食高脂飼料(High-fat diet)。EP干預(yù)劑量為200 mg/(kg·bw·d)。NaHS干預(yù)劑量為56 μmol/(kg·bw·d)。連續(xù)干預(yù)35 d，5組大鼠其他常規(guī)條件一致。

干預(yù)結(jié)束后，禁食12 h，麻醉取血，取血清，按試劑盒說明定量測定血脂水平：總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。將肝臟分離稱重，計算肝臟指數(shù)(肝重/體重×100%)，并分離腦、脾、腎、心、肺等器官，立即用液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱。

1.3 飼 料

正常飼料LAD0011(南通特洛菲飼料科技有限公司)：小麥粉，玉米粉，次粉，豆粕，玉米蛋白粉，植物油，啤酒，酵母，鹽，賴氨酸，蛋氨酸，礦物質(zhì)預(yù)混料，維生素預(yù)混料。總熱量3.4 kcal/g，熱量比為：蛋白質(zhì)22%，碳水化合物65%，脂肪13%。

高脂飼料TP0800(南通特洛菲飼料科技有限公司)：在正常飼料中添加蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鈉、酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等。總熱量5.04 kcal/g，熱量比為：蛋白質(zhì)13%，碳水化合物50%，脂肪37%。

1.4 肝臟組織病理分析

取肝臟，固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.5 血清H2S水平及腦、肺、肝、心、脾、腎組織CSE/CBS活性測定

血清中的H2S測定：100 μL血清或標準品與100 μL三氯乙酸(10%)混合，室溫反應(yīng)10 min，離心(12 000 g，4 ℃)10 min。取80 μL上清液與60 μL醋酸鋅(1%)，40 μL N，N-二甲基對苯二胺硫酸鹽(20 mmol/L溶于7.2 mol/L HCl)和40 μL FeCl3(30 mmol/L溶于1.2 mol/L HCl)混合，在室溫下反應(yīng)13 min。

組織中CSE/CBS活性測定：在100 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.4)中勻漿，離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min，取430 μL上清液與20 μL L-半胱氨酸(20 mmol/L)、20 μL 5′-磷酸吡哆醛(2 mmol/L)和30 μL 0.9%氯化鈉混合，并在37 ℃ 水浴中反應(yīng)35 min。加入250 μL的醋酸鋅(1%)和250 μL三氯乙酸(10%)以終止反應(yīng)，混勻離心(12 000 r/min，4 ℃)10 min，取500 μL上清液，加入133 μL N，N-二甲基對苯二胺硫酸鹽和133 μL FeCl3，在室溫下反應(yīng)13 min。

對剪切型三層框架建筑模型在各種地震波作用下進行加速度時程測量，包括將測量儀放在頂層和放在第二層兩種情況。將所測得的加速度時程反應(yīng)數(shù)據(jù)通過FFT（快速富利哀變換）處理轉(zhuǎn)換至頻域。然后在所得的加速度幅值譜上，從0～20Hz范圍內(nèi)等距地取出200個點的相應(yīng)幅值作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。參見圖1。

13 min后測量標準品和樣品在670 nm處的吸光度。根據(jù)NaHS(3.125～200) μmol/L校準曲線計算H2S濃度[16]，最終的酶活性[nmol/(min·g)]=1 000×組織中產(chǎn)生H2S濃度(μmol/L)/[組織勻漿蛋白濃度(mg/mL)×35 min]。

1.6 Western Blot檢測CBS、CSE蛋白表達水平

冰上制備勻漿，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，在4 ℃下與一抗(抗CSE/CBS/β-actin)孵育過夜(Proteintech)。與抗小鼠或抗兔IgG抗體(Proteintech)在室溫下孵育1 h后，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察免疫反應(yīng)帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用mean±SEM表示。多組間比較采取One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響

各組大鼠初始體重?zé)o顯著差異，高脂飼料喂養(yǎng)5周后，模型組大鼠體重顯著高于空白對照組(P<0.05)。高脂飼料喂養(yǎng)大鼠各組間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。見圖1。此外，各組大鼠的攝食量無顯著差異。

2.2 EP對高脂飲食大鼠肝臟的影響

高脂飼料喂養(yǎng)可使大鼠肝臟體積增大并出現(xiàn)脂肪變性，肝臟顏色由深棕色變?yōu)樽攸S色(圖2A)。正常飼料喂養(yǎng)的兩組大鼠，肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞形態(tài)完整。而模型組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞體積明顯變大呈氣球樣變，胞核固縮且數(shù)量明顯減少，空泡變多，周圍部分區(qū)域有炎癥細胞浸潤。EP和NaHS干預(yù)后肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細胞形態(tài)趨于正常，體積增大但形態(tài)仍較完整，脂肪變性細胞數(shù)量減少，有輕微的炎性細胞浸潤(圖2B)。

圖1 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重的影響Fig.1 Effects of EP on body weight gain of the rats fed with high-fat diet

正常飲食的兩組大鼠肝臟系數(shù)無顯著差異(P>0.05)；高脂飲食的三組大鼠肝臟系數(shù)顯著高于正常飲食的兩組(P<0.05)；而同樣喂食高脂飼料的三組大鼠， EP和NaHS干預(yù)后，肝臟系數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血清TC、TG、LDL-C水平的影響

高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的TG、TC和LDL-C顯著高于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較，EP和NaHS干預(yù)可顯著降低血清TG、TC和LDL-C水平(P<0.05)。見圖3。

2.4 EP對H2S水平和肝、心、腦、腎、脾CSE/CBS酶活性的影響

正常飼料喂養(yǎng)的兩組大鼠中，與空白對照組比較，EP對照組血清H2S水平無顯著改變，但在高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠中，EP和NaHS干預(yù)后血清H2S水平顯著高于模型組(P<0.05)。模型組大鼠肝、心、腦的CBS/CES酶活性顯著低于空白對照組(P<0.05)，EP和NaHS干預(yù)后CBS/CES活性升高(P<0.05)。不論是正常飲食還是高脂飲食，EP均能提高腎、脾的CBS/CES活性(P<0.05)。肺組織中CBS/CES活性低于檢測限值(<3.125 μmol/L)。見圖4。

A：干預(yù)期結(jié)束后肝臟大體外觀比較；B：大鼠肝臟HE染色結(jié)果(×400)，箭頭示脂肪空泡圖2 EP對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝的影響Fig.2 Effects of EP on livers of the rats fed with high-fat diet

表1 各組大鼠干預(yù)期結(jié)束后的肝臟系數(shù)比較

A：大鼠血清TG濃度水平；B：大鼠血清TC濃度水平；C：大鼠血清LDL-C濃度水平；D：大鼠血清HDL-C濃度水平。a：與Control組比較，P<0.05；b：與模型組比較， P<0.05圖3 EP干預(yù)對大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平的影響Fig.3 Effects of EP on TG，TC，LDL-C and HDL-C in the serum of the rats in each group

A：大鼠血清H2S濃度水平比較；B：大鼠肝臟CSE/CBS酶活性比較；C：大鼠心臟CSE/CBS酶活性比較；D：大鼠大腦CSE/CBS酶活性比較；E：大鼠腎臟CSE/CBS酶活性比較；F：大鼠脾臟CSE/CBS酶活性比較。a：與Control組比較，P<0.05；b：與Model組比較， P<0.05；c：與高脂飼料喂養(yǎng)的EP干預(yù)組比較，P<0.05圖4 EP對大鼠血清H2S濃度及各臟器CSE、CBS酶活性的影響Fig.4 Effects of EP on H2S level in the serum and CSE/CBS activity in liver，heart，brain，kidney and spleen

2.5 EP對各器官CBS、CSE蛋白表達的影響

如圖5所示，與模型組相比，EP干預(yù)組大鼠腦內(nèi)CBS和CSE蛋白表達均顯著增加(P<0.05)。在脾臟和肝臟，EP顯著增加高脂飲食喂養(yǎng)大鼠CBS蛋白的表達(P<0.05)，但對CSE的表達無明顯影響(P>0.05)。在心臟和腎臟，EP顯著增加高脂飲食喂養(yǎng)大鼠CSE蛋白的表達(P<0.05)，而對CBS的表達無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)成年雌性SD大鼠35 d建立NAFLD模型，模型組肝重、肝臟指數(shù)、肝臟病理切片、血脂等指標的變化，均提示造模成功。

表2 高脂飲食喂養(yǎng)大鼠血清H2S水平與脂質(zhì)指標的相關(guān)性分析

EP干預(yù)可降低高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠的血清TC、TG、LDL-C水平，減少肝細胞脂肪變性。由此可見，EP可以改善NAFLD大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝，但對正常飲食大鼠脂質(zhì)代謝無明顯影響。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠血清 H2S水平與血清TC、TG以及LDL-C水平呈負相關(guān)關(guān)系，由此推測EP 改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝的作用可能與其調(diào)節(jié)血清H2S含量有關(guān)。

H2S是一種重要的內(nèi)源性血管舒張因子，有研究表明，H2S可通過抗炎、抗氧化和抗纖維化[17]等作用，延緩大鼠肝纖維化并抑制肝臟脂代謝紊亂。有研究報道，NAFLD大鼠內(nèi)源性H2S形成受損，H2S治療可能通過減輕氧化應(yīng)激和抑制炎癥來延緩NAFLD的發(fā)生發(fā)展[18]。在本研究中，NaHS作為外源性H2S供體，能夠升高NAFLD大鼠體內(nèi)H2S濃度，而EP干預(yù)后H2S濃度變化與NaHS干預(yù)后結(jié)果一致，提示其可能作為H2S供體促進H2S的生成。

A：大鼠腦組織CBS、CSE蛋白表達；B：大鼠肝臟組織CBS、CSE蛋白表達；C：大鼠脾臟組織CBS、CSE蛋白表達；D：大鼠心臟組織CBS、CSE蛋白表達；E：大鼠腎臟組織CBS、CSE蛋白表達。a：與Control組比較，P<0.05；b：與Model組比較， P<0.05圖5 EP對大鼠各臟器CSE、CBS蛋白表達的影響Fig.5 Effects of EP on CSE and CBS protein expression in liver，heart，brain，kidney and spleen

哺乳動物體內(nèi)，CSE主要存在于心血管系統(tǒng)、肝臟和腎臟[19]中，而CBS則主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或神經(jīng)元中，在大腦的海馬體和小腦中高度表達[20]。本研究觀察到大鼠腦、脾、肝、腎和心臟均有CSE和CBS的表達。但在不同臟器中，其活性不同，在肺中其活性低于檢測限。在高脂飼料喂養(yǎng)的三組大鼠中，EP及NaHS干預(yù)后，各臟器CSE/CBS酶活性較模型組顯著升高。說明EP對NAFLD大鼠體內(nèi)CSE/CBS酶的活性有保護和促進的作用。此外，在EP干預(yù)后，NAFLD大鼠腦內(nèi)CBS和CSE的蛋白表達顯著增加；在脾臟和肝臟，EP主要影響CBS蛋白表達；在心臟和腎臟中，EP則主要影響CSE蛋白的表達。這些結(jié)果表明EP對NAFLD大鼠不同臟器組織CBS、CSE表達的影響不同。提示EP可能通過影響CSE、CBS蛋白的表達，促使內(nèi)源性H2S含量升高。但在正常飲食大鼠體內(nèi)各臟器中，EP對CSE、CBS的表達均無顯著影響。

同型半胱氨酸(Hcy)是產(chǎn)生H2S的底物。動物研究表明，缺乏CSE或CBS會導(dǎo)致血清中Hcy水平升高或高同型半胱氨酸血癥[21]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，EP可增加高脂飲食大鼠的血清L-半胱氨酸水平，而CSE活性抑制劑則可抑制EP引起的H2S升高，并顯著增加EP干預(yù)組大鼠的血清Hcy水平。肝臟是Hcy代謝的關(guān)鍵器官，可調(diào)節(jié)血漿Hcy水平[22]。本研究結(jié)果顯示，EP可上調(diào)肝臟CBS蛋白表達和CBS活性，表明EP可能具有預(yù)防高同型半胱氨酸血癥的作用。

綜上所述，EP可能通過上調(diào)NAFLD大鼠多個器官CBS/CSE蛋白表達，提高CBS/CSE酶活性，從而提高血清H2S水平，改善NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝。此外，H2S還具有其他多種生物學(xué)效應(yīng)，本研究結(jié)果為EP的其他生物活性效應(yīng)研究提供了新的線索。