基于藻類光合作用抑制效應的敵草隆毒性響應參數研究

胡 麗，陳 敏，殷高方，趙南京，甘婷婷

1.合肥師范學院物理與材料工程學院，安徽 合肥 230061 2.中國科學院安徽光學精密機械研究所中科院環境光學與技術重點實驗室，安徽 合肥 230031 3.中國科學技術大學研究生院科學島分院，安徽 合肥 230026

引 言

隨著現代化農業的快速發展，各種各樣除草劑被過量使用，大量殘存的除草劑進入水環境中，給流域生態環境、水產養殖和飲水安全帶來巨大威脅[1]。區別理化分析方法，水質生物毒性檢測方法利用生物在脅迫條件下的生理或行為等變化衡量污染物毒性，能綜合反映污染物對生態系統的危害程度，滿足生態環境風險評估需求[2]。藻類作為單細胞生物，其個體小、繁殖快、對毒物敏感、易于培養，是水質生物毒性檢測的理想受試生物[3]，國際經合組織將“藻類生長抑制試驗”列為化學品毒性測試標準方法，以96h作用下藻類細胞密度生長的半數抑制效應濃度(EC50)來表征急性毒性作用的程度。然而，“藻類生長抑制試驗”依賴于藻類細胞的繁殖代謝過程，毒性響應慢，測量周期長[4]，已有研究表明細胞形態結構破壞、細胞酶活性變化、遺傳物質損傷等抑制細胞生長因素都會作用于光合作用過程[5]，其響應速度和靈敏度明顯優于“藻類生長抑制試驗”[6]。近年來，人們開展了一些污染物毒性的藻類光合抑制實驗，熒光測量多跟隨國外技術(如PAM[7])，獲得的光合熒光參數大多與可變熒光Fv或最大光化學量子產量Fv/Fm有關。已有研究也多選用Fv或Fv/Fm表征藻類受脅迫程度[8]，如Mallick等[9]實驗證明(F0/Fv)是評估重金屬毒性的最佳參數；Pérez等[10]研究認為可變熒光(Fv)對Cu2+脅迫響應最為快速敏感；Tiam等[11]研究表明快速光響應曲線的反演參數Yield(光照狀態下PSⅡ的實際量子產量)對農藥毒性更敏感，是較好的藻類生物毒性反應終點。然而，隨著研究的深入，研究者發現不同類型污染物對藻類細胞產生毒性效應的光合作用位點和損傷程度具有明顯差異，與之對應的敏感熒光參數差異較大[12]。現有研究采用單一、固定的光合熒光參數作為生物毒性反應終點，缺乏對多個光合熒光參數響應敏感性的對比分析，造成生物毒性定量檢測的靈敏度不高。因此，針對特定污染物(如除草劑)，在準確獲得多個光合熒光參數的基礎上，如何從眾多的光合熒光參數中篩選出能夠精確反映其抑制效應的關鍵參數，成為當前該領域急需解決的問題。

本研究以蛋白核小球藻為受試對象，以葉綠素熒光作為藻類光合作用狀態快速無損探針，采用熒光動力學手段測量藻類光合熒光參數，對典型除草劑敵草隆(dichlorophenyl dimethylurea，DCMU)抑制下的多個光合熒光參數的毒性響應敏感性進行對比分析，得到適用于快速、定量評價DCMU脅迫效應的關鍵光合參數，提高DCMU生物毒性檢測的速度和靈敏度。

1 實驗部分

1.1 藻種培養與溶液配制

實驗選取的蛋白核小球藻選種及擴大培養方法同參考文獻[8]，實驗在100 mL三角錐形瓶中進行，量取藻液50 mL，實驗藻類初始葉綠素濃度控制在100～200 μg·L-1，DCMU脅迫物的添加體積為1 mL(排除藻液稀釋造成的干擾)，根據預實驗結果，DCMU抑制液濃度梯度設定為1，2，5，10，20，40，80和160 μg·L-1，每個樣品設置3個平行樣。

1.2 光合熒光參數及獲取

藻類光合熒光參數通過可變光脈沖誘導葉綠素熒光分析儀(AGHJ-TPLIF-I，中國科學院安徽光學精密機械研究所研制)測量[13]。該儀器通過測量水體藻類葉綠素熒光動力學曲線及光合響應曲線(FLC曲線)，能夠在數十秒內準確反演獲得表征藻類光合作用過程特征的光合熒光參數，儀器主要功能結構如圖1所示，得到的光合熒光參數如表1所示。

圖1 可變光脈沖誘導葉綠素熒光分析儀結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of chlorophyll fluorescence analyzer induced by variable light pulse

表1 可變光脈沖誘導葉綠素熒光分析儀測量得到的光合熒光參數Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters acquired by the chlorophyll fluorescence analyzer

光合熒光參數對DCMU的響應結果以抑制率和促進率表征，分別用Y抑制和Y促進表示，其計算公式見式(1)和式(2)[14]

(1)

(2)

式中，X0為對照組光合熒光參數數值；Xi為實驗組光合熒光參數數值。

2 結果與討論

根據預實驗結果，選取DCMU脅迫5 min后的對照組和實驗組12個光合熒光參數，利用成對樣本T檢驗得到實驗組與對照組的顯著性差異，初步篩選有顯著性響應的參數。結果表明，DCMU在蛋白核小球藻的多個光合作用位點都產生了抑制，10個光合熒光參數F0，Fm，σPSⅡ，τQA，Fv，Fv/Fm，Yield，rP，NPQ，α存在顯著性差異；JVPⅡ和Ek在測量濃度范圍內出現了中濃度區域顯著響應，但低濃度和高濃度區域非顯著性響應，不適宜作為生物毒性定量檢測的響應指標。因此，選取上述10個顯著響應參數，進一步研究DCMU毒性作用下的時間和劑量效應關系。

2.1 時間效應關系

根據預實驗結果，實驗測試周期設置為5 min，1 h，3 h，6 h，24 h，48 h，72 h和96 h，得到10個顯著響應參數在DCMU抑制下的時間-效應變化規律。同時，為了比較光合抑制和生長抑制的差異，以藻類葉綠素含量(chlorophyll，Chl，可變光脈沖誘導葉綠素熒光分析儀測量)代替藻類生物量，得到DCMU抑制下的藻類生物量隨時間的響應規律。

結果表明，10個光合熒光參數可分為三類：第一類為表征藻類生長狀態的參數α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ，各參數的時間-效應趨勢大致相同，如圖2所示。樣液的抑制率在測量周期內呈現出先下降的趨勢，6 h后抑制率達到最低值；后呈現上升趨勢，48 h后基本趨于穩定，且此時的抑制率值基本和5 min的測量值持平。6 h內抑制率下降可能與受試藻類毒性脅迫自適應有關，但藻類細胞自適應能力達到極限后，毒性脅迫效應將隨時間延長呈增加趨勢，直至穩定，這與文獻[8]研究結果一致。因此，考慮到生物毒性快速測量需求，可以選擇5 min作為定量測量的時間節點，此時的測量數據可以代表長期(如96 h)抑制效果。

圖2 光合熒光參數α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ時間響應變化趨勢Fig.2 The variation trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with time

第二類為F0，Fm和Fv，結果如圖3所示。在整個測量周期內，低濃度樣液呈現出刺激生長效應，在48 h后趨于穩定；而中高濃度樣液呈現先促進后抑制的效應，6 h為時間拐點，之后抑制率隨時間呈累積增長效應，在48 h后趨于穩定，這種先促進后抑制的趨勢類似第一類參數，與藻類毒性脅迫短期內的自適應效應和脅迫極限有關。同時，對比上述參數和藻類生長抑制的時間響應規律(即chl-a含量隨時間的變化趨勢)，發現其響應規律類似，說明參數F0，Fm和Fv除了與藻類的生長狀態有關外，還與藻類生物總量有關。因此，第二類參數同藻類生長抑制方法，適合選取較長時間為定量測量的時間節點(如48 h)，以獲得較為穩定、精確的測試結果。

圖3 光合熒光參數F0，Fm、Fv和Chl時間響應變化趨勢Fig.3 The variation trend of F0， Fm， Fv and Chl with time

第三類為光合參數σPSⅡ和τQA，此類參數的抑制率值在整個測量周期內都是負值，為研究方便，使用促進率表征參數對DCMU的響應規律，如圖4所示。樣液的促進率在6 h內呈現出下降的趨勢，6 h后隨時間延長累積變化較小，基本趨于穩定。因此，可以選擇6 h作為第三類參數毒性測量的時間節點，確保此時的測量數據與長時間測量數據保持一致，避免短時測量出現假陽性的結果。

圖4 光合熒光參數σPSⅡ和τQA時間響應變化趨勢Fig.4 The variation trend of σPSⅡ and τQA with time

綜合三類參數的時間響應規律，考慮到DCMU生物毒性快速測量的需求，選取5 min作為測量的時間節點，第一類參數Yield，rp，α，Fv/Fm和NPQ作為定量測量的關鍵光合參數，進一步研究其劑量效應關系。

2.2 劑量效應關系

根據2.1節，進一步分析關鍵參數Yield，rp，α，Fv/Fm和NPQ在DCMU 5 min抑制時的劑量效應關系，并與96 h長時抑制的劑量效應關系進行對比，以確保短時測量結果的準確性和有效性。通常生物毒性實驗獲取的毒性強度與受試生物受抑制程度間的劑量-效應曲線呈現反“S”形，一般以阻滯增長模型(Logistic)為基礎進行非線性擬合[15]。以抑制物濃度代表其毒性強度，光合參數的抑制率代表受試生物受抑制程度，利用Logistic函數進行擬合，得到對應的擬合相關系數及EC50值。結果顯示，DCMU抑制5 min后，參數α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ抑制率對DCMU濃度具有良好的劑量效應關系(如圖5)，擬合相關系數R2分別為0.996 9，0.997 3，0.998 5，0.998 5和0.998 5，由此得到的EC50-5 min值分別為10.31，11.59，13.03，13.94和2.41 μg·L-1，如表2所示。對比96 h長時抑制的劑量效應關系，結果表明參數Yield，rp，α，Fv/Fm的擬合相關系數短時效應優于長時效應，但EC50值長時效應優于短時效應。同時，實驗還表明參數NPQ對DCMU毒性的響應靈敏度和響應速度極佳，其5 min抑制對應的相關系數和EC50優于其他四個參數，且優于96h的測量結果。因此，可以選取參數NPQ作為5min定量測量DCMU生物毒性的響應指標，既可大幅縮短檢測時間，還可以提高檢測的靈敏度。

表2 5 min和96 h抑制的擬合相關系數和EC50值Table 2 The fitting correlation coefficient and EC50 value of 5 min and 96 h inhibition

圖5 5 min脅迫下α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ值隨DCMU濃度的變化趨勢Fig.5 The trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with DCMU concentration under 5 min stress

3 結 論

基于藻類光合熒光參數的生物毒性監測方法，具有響應快速、參數豐富、測量簡捷的特點。對DCMU抑制下的多個光合熒光參數毒性響應敏感性進行了對比分析，首先通過成對樣本T檢驗，得到光合熒光參數F0，Fm，σPSⅡ，τQA，Fv，Fv/Fm，Yield，rP，NPQ，α顯著響應；通過分析顯著響應參數的時間-效應規律，得到參數α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ在5 min即體現出類似長時抑制效應的關系，5 min可作為DCMU毒性分析的時間測量節點；最后，研究5 min脅迫下DCMU濃度與參數α，rP，Fv/Fm，yield，NPQ抑制率之間的劑量-效應關系，利用Logistic函數進行擬合，同時對比96 h長時抑制的劑量效應關系，結果顯示參數NPQ的相關系數和EC50分別為0.998 5和2.41 μg·L-1，顯著優于其他四個參數，且優于96 h的測量結果。因此，采用光合熒光參數NPQ作為5 min定量測量DCMU生物毒性的反應終點，可極大縮短DCMU生物毒性檢測的檢測時間(從數小時縮短至5 min)，并顯著提高檢測靈敏度(與光合抑制方法常規參數Fv/Fm相比，EC50降低了81.4%)。實驗結果為基于藻類光合抑制效應的DCMU生物毒性定量檢測提供了基礎數據，研究方法也為其他污染物脅迫下的藻類光合熒光參數篩選提供了參考。