基于同步熒光光譜的雞肉中甲磺酸達氟沙星和氧氟沙星殘留快速檢測方法研究

陳 健,黃俊仕,2,劉木華,2,袁海超,2,黃雙根,2，趙進輝,2*,徐 寧,王 婷,胡 圍

1.江西農業大學，江西省現代農業裝備重點實驗室，江西 南昌 330045 2.江西農業大學，江西省果蔬采后處理關鍵技術及質量安全協同創新中心，江西 南昌 330045

引 言

喹諾酮類抗生素(Quinolones)是一類人工合成的廣譜抗生素，在家禽飼養和疾病的防治中被廣泛應用[1]。我國的家禽養殖向著規模化、集約化方向發展，抗生素發揮著越來越重要的作用，但抗生素的不規范、不合理使用導致禽肉抗生素殘留的問題也日趨嚴重[2]。甲磺酸達氟沙星(danofloxacin mesylate，DFM)和氧氟沙星(ofloxacin，OFL)是常用的喹諾酮類抗生素，其殘留進入人體可能引起癌癥、基因突變等[3]。因此，建立一種快速、經濟的雞肉中DFM和OFL殘留的檢測方法是一項十分有意義的工作。基于對消費者安全的考慮，農業農村部限定了雞肉中喹諾酮類抗生素的最大殘留限量，其中達氟沙星的最大殘留限量為200 μg·kg-1，OFL被禁用[4-5]。

目前，液相色譜法[6-7]、液相色譜和質譜聯用法[8-9]等方法可用于雞肉中喹諾酮類抗生素殘留的檢測，這些方法雖然有較高的靈敏度，但儀器昂貴、運行成本高且需要較高的操作水平[10]。同步熒光技術同時掃描激發和發射單色器波長，同時利用了化合物的吸收特性和發射特性，具有簡化光譜、窄化譜帶、減弱背景干擾和降低散射光等優點[11]。近年來，李月秋等[12]應用同步熒光技術檢測豬肉中頭孢噻呋抗生素的殘留量，蔡其洪等[13]應用同步熒光技術檢測火腿腸、豬肉、魚肉、鴨肉和雞肉中氟羅沙星抗生素的殘留量。本研究以雞肉為載體，DFM和OFL抗生素為研究對象，應用同步熒光技術嘗試建立一種雞肉中DFM和OFL殘留快速檢測的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(Cary Eclipse，美國瓦里安)；電子天平(FA1004B，上海上平儀器有限公司)；純水機(全自動RO，湖南科爾頓水務有限公司)；超聲波清洗器(JK-50B，合肥金尼克機械有限公司)；漩渦混合器(VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器有限公司)；振蕩器(KJ-201BS，江蘇康健醫療用品有限公司)；低速離心機(JW-1024，安徽嘉文儀器裝備有限公司)；組織搗碎勻漿機(JJ-2B，江蘇省金南儀器廠)；石英比色皿(1 cm光程，宜興市晨偉玻璃儀器廠)。

雞胸肉(南昌市某大型超市)；DFM和OFL(≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈、甲酸和氫氧化鈉(分析純，西隴科學股份有限公司)；十二烷基硫酸鈉(分析純，SDS，金克隆北京生物技術有限公司)；溴代十六烷基三甲胺(分析純，CTAB，金克隆北京生物技術有限公司)；壬基酚聚氧乙烯醚系列(7)醚(分析純，NP-7，上海麥克林生化科技有限公司)；有機相針式濾器(0.45 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 樣品制備

(1)抗生素儲備液的配制：取5.0 mg的DFM(或OFL)標準品溶于50 mL超純水，可得到100 mg·L-1DFM(或100 mg·L-1OFL)儲備液，于4 ℃下儲存。

(2)抗生素工作液的配制：取0.15 mL的DFM(或OFL)儲備液，用超純水稀釋至15 mL得到1.0 mg·L-1DFM(或OFL)工作液，于4 ℃下儲存。

(3)根據文獻[14]中的快速溶劑萃取法提取空白雞肉，略作修改，具體如下：稱取均質的雞胸肉1.0 g，置于10 mL離心管中，加入2%甲酸-乙腈溶液4 mL，渦旋1 min，然后，于離心機上以4 000 r·min-1的速率離心5 min，將上清液移入另一個10 mL離心管中，將離心殘渣用4 mL 2%甲酸-乙腈溶液再提取一次，合并上清液，混勻，過0.45 μm濾膜，用2%甲酸-乙腈定容至10 mL，得到空白雞肉提取液。

(4)根據文獻[14]中的快速溶劑萃取法提取雞肉中DFM和OFL的殘留，略作修改，具體如下：①加標雞肉的制備：稱取均質的雞胸肉1.0 g，置于10 mL離心管中，分別添加0.01，0.04，0.08，0.10，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mL 的DFM儲備液和0.01，0.04，0.08，0.10，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28，0.32，0.36，0.40和0.44 mL的OFL儲備液，兩者濃度隨機組合，渦旋1 min。②雞肉中抗生素的提取：再加入2%甲酸-乙腈溶液4 mL，渦旋1 min，然后，于離心機上以4 000 r·min-1的速率離心5 min，將上清液移入另一個10 mL離心管中，將離心殘渣用4 mL 2%甲酸-乙腈溶液再提取一次，合并上清液，混勻，過0.45 μm濾膜，用2%甲酸-乙腈定容至10 mL。得到含DFM和OFL的雞肉提取液：DFM濃度為0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0和4.4 mg·L-1(分別對應于雞肉中含有1.0，4.0，8.0，10.0，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0和44.0 mg·kg-1DFM)，OFL濃度為0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0和4.4 mg·L-1(分別對應于雞肉中含有1.0，4.0，8.0，10.0，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0和44.0 mg·kg-1OFL)。

1.3 標準溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜的采集

為了采集標準溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜，分別取500 μL DFM標準溶液(1.0 mg·L-1)、OFL標準溶液(1.0 mg·L-1)、空白雞肉提取液和含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)于不同的石英比色皿中，再先后加入130 μL SDS緩沖液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，采集波長差Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.4 定性試驗設計方案

(1)為了探究不同氫氧化鈉溶液濃度對同步熒光強度的影響，向石英比色皿中依次加入500 μL含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)，130 μL SDS溶液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.001，0.01，0.1，0.2，0.3和0.4 mol·L-1)，設置5個平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

(2)為了探究不同表面活性劑對同步熒光強度的影響，向石英比色皿中依次加入500 μL含DFM和OFL的雞肉提取液(1.0 mg·kg-1DFM，1.0 mg·kg-1OFL)，130 μL CTAB表面活性劑(0.019 mol·L-1)或SDS表面活性劑溶液(0.1 mol·L-1)或NP-7表面活性劑(5.33 mmol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，設置5個平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.5 定量試驗設計方案

向石英比色皿中依次分別加入500 μL的含不同濃度DFM和OFL的雞肉提取液，130 μL SDS溶液(0.1 mol·L-1)，670 μL氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)，設置5個平行組，采集Δλ=130和200 nm處的同步熒光光譜。

1.6 熒光光譜儀參數設置

熒光光譜儀參數設置如下：激發波長掃描范圍為240～450 nm，激發、發射狹縫寬度均為5 nm，PMT電壓為700 V。

1.7 數據處理方法

2 結果與討論

2.1 標準溶液以及雞肉提取液的同步熒光光譜

DFM和OFL具有相似的化學結構，進而有類似的熒光特性。為了實現辨別的目的，須要找到合適的Δλ。圖1給出了DFM和OFL標準溶液的同步熒光光譜圖，從中看出，DFM和OFL熒光光譜有明顯區別，在Δλ=130 nm時，可由282 nm處寬譜峰辨別出DFM。在Δλ=200 nm時，可由318 nm處寬譜峰辨別出OFL。圖2給出了雞肉提取液的同步熒光光譜圖。從中看出，雞肉中DFM和OFL的熒光激發峰相對標準溶液中DFM和OFL的熒光激發峰發生紅移現象。含DFM和OFL的雞肉提取液在Δλ=130 nm處有位于288 nm處DFM的熒光激發峰，在Δλ=200 nm處有位于325 nm處OFL的熒光激發峰，而空白雞肉提取液在這些位置處未出現寬譜峰。綜上所述，雞肉中DFM和OFL殘留可通過Δλ/激發波長130/288 nm和200/325 nm實現同時檢測。

圖1 DFM和OFL標準溶液的同步熒光光譜圖Fig.1 Synchronous fluorescence spectra of DFM and OFL standard solutions

2.2 同步熒光光譜檢測條件優化

由圖3(a)可知，隨著氫氧化鈉溶液濃度增加，DFM的熒光強度呈先增強，后減弱的趨勢。對于OFL而言，熒光強度也呈先增強，后減弱的趨勢。產生熒光強度變化的原因可能是氫氧化鈉溶液濃度的增加，體系pH會升高，進而影響了DFM和OFL的質子離解平衡[15]，影響了它們的熒光強度。在氫氧化鈉溶液濃度為0.1 mol·L-1時，DFM和OFL的熒光強度最大。因此，0.1 mol·L-1為氫氧化鈉溶液最佳的加入濃度。

圖3 不同條件對熒光強度的影響(a):氫氧化鈉溶液濃度；(b):表面活性劑Fig.3 Effects of difference conditions on the fluorescence intensities(a):Concentration of sodium hydroxide solution;(b):Surfactants

表面活性劑具有熒光增敏的效果，被廣泛應用于熒光檢測。表面活性劑達到臨界膠束濃度時能形成膠束，使DFM和OFL分子處于有序的微環境，減少了分子間的碰撞概率[16]。在本試驗中SDS在體系中濃度為10.0 mmol·L-1，大于其臨界膠束濃度8.0 mmol·L-1[17]。由圖3(b)可知，在加入SDS表面活性劑時，DFM絡合物的熒光強度最大。另一方面，在加入SDS表面活性劑時，OFL絡合物的熒光強度最大。因此，選用SDS表面活性劑。

2.3 主成分分析

PCA是一種經典的多元統計分析技術，其中心目的是將光譜的數據降維。表1給出了前4個主成分的方差貢獻率和累計方差貢獻率。從中可見，DFM和OFL前3個主成分的累計方差貢獻率均達到了90%。隨著主成分數增大，其方差貢獻率逐漸減小。通常主成分數大于90%的累計方差貢獻率就能代表原始變量的大部分信息[18]。因此，選擇前3個主成分進行PLSR和MLR分析。

表1 前4個主成分的方差貢獻率和累計方差貢獻率Table 1 Variance contribution rate and cumulative variance contribution rate for the first four principal component

2.4 預測模型的建立和預測結果的分析

含DFM和OFL的雞肉提取液樣本共13個，隨機選取7個樣本作為訓練集，以建立預測模型，剩余6個作為預測集，以分析模型預測結果，預測集的數據都落在訓練集的范圍之內，如表2所示。

表2 雞肉中DFM和OFL殘留的樣本統計結果Table 2 Statistical results of samples of DFM and OFL residues in chicken

表3 雞肉中DFM和OFL殘留的模型預測統計結果Table 3 Statistical results of prediction model of DFM and OFL residues in chicken

綜合上述的信息得出基于PLSR的DFM殘留預測模型和基于MLR的OFL殘留預測模型的綜合評價更好，因此本試驗分別用PLSR和MLR算法建立雞肉中DFM和OFL殘留的預測模型，檢測雞肉中DFM和OFL殘留的檢出限均可達1.0 mg·kg-1，并繪制了雞肉中DFM和OFL殘留的樣本關系圖(見圖4)。本方法能夠滿足雞肉中DFM和OFL殘留快速同時檢測要求，對后續研究具有一定的參考價值。

圖4 雞肉中DFM和OFL殘留的樣本關系圖Fig.4 Plots of the relationship between the actual and predicted values of DFM and OFL residues in chicken for the training and prediction samples

3 結 論

采用同步熒光技術結合化學計量學方法，建立了雞肉中DFM和OFL殘留快速檢測的方法。試驗結果表明，采用同步熒光技術可有效的分辨出雞肉提取液、DFM和OFL的熒光特征峰，使雞肉中DFM和OFL殘留被同時檢測，簡化了檢測步驟，為雞肉中抗生素殘留的快速檢測提供技術支持。