基于熒光光譜技術研究增效肥料對土壤富里酸熒光特性的影響

胡 鈺，魏 丹，*，李 艷，王 偉，白 楊，金 梁，蔡姍姍

1.東北農業大學資源與環境學院，黑龍江 哈爾濱 150030 2.北京市農林科學院植物營養與資源研究所，北京 100097 3.黑龍江省農業科學院土壤肥料與環境資源研究所，黑龍江 哈爾濱 150086 4.沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧 沈陽 110866

引 言

土壤腐殖質占土壤有機質的60%～90%，土壤腐殖質是土壤有機物存在的一種特殊的形式，根據其在所有酸性和堿性溶液下溶解度的明顯差異，可按其溶解度分為三個組分，在所有pH下均可溶的富里酸(FA)、在酸性條件下(通常pH<2)不溶的胡敏酸(HA)和在酸堿條件下均不溶的胡敏素(HU)。衡量土壤肥力的一個重要的指標就是土壤腐殖質，土壤腐殖質對土壤理化特性有著很大的影響，例如通過增加土壤團聚體和土壤通氣能力達到保水的目的，增加土壤微生物可加快有機物的礦化并提高生物利用度，同時也能促進一些大量營養元素和微量營養元素用于植物吸收以及微生物生長，許多學者將其視為研究的熱點[1]。FA是腐殖酸和土壤溶解性有機碳庫的重要組成部分，土壤FA比土壤HA具有更高生物可利用性和理化活性，在土壤中有機物質的遷移、礦化進程中起到了重要的作用[2]。因此，有學者開始使用各種分析方法分析FA的結構特性、物質組成[3]。根據三維熒光光譜和平行因子分析法(PARAFAC)，可以將復雜的三維熒光光譜分解為單獨的熒光成分，并減弱熒光化合物之間的干擾，因此已成為定性和定量描述溶解性有機質特定熒光信息的靈敏且可靠的分析方法，從而揭示熒光光譜所存在的無法識別的差異，是解析溶解性有機質和腐殖酸類物質結構、組成特性的重要資料和方法。以往研究報道對應用熒光光譜探明肥料對于土壤FA熒光特性和結構特征的影響的關注較少[4]。納米碳作為肥料增效劑可促進植物發育、改善土壤性狀，而將納米碳作為肥料包膜材料與熒光特性之間關系的研究卻較少，有研究表明[5-6]，發現它可以在一定程度上可提高土壤酶和土壤微生物的活性，間接提高土壤腐殖化程度。沸石作為肥料增效劑具備許多優勢，但是應用熒光光譜探究沸石材料的熒光特性的研究卻很少，在土壤中施入沸石，能夠在一定程度上減少有效營養元素及養分的損失[7]，提高土壤腐殖化程度[8]。Beesley等[9]研究表明，向土壤中施入生物炭，可以增加土壤孔隙水中的溶解性有機碳；趙世翔[10]和Laird[11]等研究表明，生物炭施入量越大，土壤有機碳含量越高。

基于此，使用熒光光譜和平行因子分析的方法，對施入納米碳包膜肥料、沸石包膜肥料以及生物炭包膜肥料的土壤FA組成及其結構進行分析評價，主要的目標是三個：(1)分析增效肥料對土壤FA結構特性和熒光特性的影響；(2)探究增效肥料對土壤FA熒光組分的影響；(3)初步闡明增效肥料對于土壤腐殖化程度的影響。這對于提升土壤腐殖化程度，拓展肥料和包膜材料的用途以及資源的可持續利用，具有重要的理論和實踐意義。

1 實驗部分

1.1 設置

試驗于2018年5月在黑龍江省嫩江縣、愛輝區進行。試驗設置5個處理，各施肥處理、施肥內容以及施肥量詳見表1，氮肥為尿素；磷肥為磷酸二銨；鉀肥為硫酸鉀。納米增效肥料是以3‰的液體納米碳對尿素和磷酸二銨在實驗室下進行包膜處理；沸石增效肥料是以18%的沸石粉對尿素和磷酸二銨在實驗室下進行包膜；炭基肥料是以18%的生物炭粉在實驗室下對尿素和磷酸二銨進行包膜。指示作物為大豆(黑河43) ，采用大豆壟上雙行栽培技術，于2018年9月采集表層0～20cm的土壤樣品。

表1 施肥處理與對應肥料Table 1 Fertilization treatment and corresponding fertilizer

1.2 樣品采集和實驗方法

1.2.1 FA提取與純化[1]

準確稱取過0.25 mm篩土樣5.00 g，加入30 mL去離子水，震蕩(180 r·min-1，50 ℃)浸提24 h，離心(3 500 r·min-1)15 min得上清液，用去離子水定容至50 mL并取30 mL于三角瓶中，用6 mol·L-1HCL調節pH使pH 1.0，靜置12 h后離心(3 500 r·min-1)15 min，得上清液過濾。將濾液定容至50 mL，過0.45 μm纖維樹脂濾膜，即得含粗FA的濾液。將濾液通過樹脂柱，即可以完成FA的純化過程。

1.2.2 熒光光譜測定

待測FA樣品經TOC分析儀(multi N/C 2100)測定其濃度，將所有FA樣品稀釋至一致濃度，采用三維熒光光譜儀(日立F-7000)測定熒光光譜參數。主要性能參數：激發波長(Ex)掃描范圍：200～490 nm，帶寬10 nm；發射波長(Em)掃描范圍：250～550 nm，帶寬5 nm。PARAFAC分析時，應消除水離子的散射，消除拉曼散射對熒光數據的影響。

1.3 數據分析

利用MATLAB 2010進行三維熒光圖譜的繪制和PARAFAC分析；利用ORIGIN 9.1計算三維熒光區域積分、FI指數(Em在470和520 nm處熒光強度的比值)和BIX指數(Ex在310 nm處，Em在380與430 nm處熒光強度的比值)；利用SPSS 19.0進行相關分析。

2 結果與討論

2.1 不同增效肥料的土壤富里酸三維熒光特性差異

根據Chen等[12]提出的三維熒光區域積分(FRI)方法，計算熒光三維圖譜各區域熒光響應比值(percent fluorescence response，Pi，n) 。Tang等[13]對溶解性有機質( DOM) 的三維熒光圖譜進行了熒光區域積分將其分為五個熒光區域，根據三維熒光區域積分(FRI)的方法，各個區域所對應的物質相對含量可由Pi，n值反映，將紫外熒光FA區域Ⅲ、可見熒光FA區域Ⅴ所對應的物質相對含量(Pi，n)記為PⅢ，n，PⅤ，n，PⅤ，n/PⅢ，n可以用來反映土壤的腐殖程度[14]，其中Pi，n越大，土壤的腐殖化程度也就越大。

由表2、表3可知，嫩江試驗區的T1處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.69，比CK處理增加了4.26%，較NE處理增加了0.37%；愛輝試驗區的T1處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.67，比CK處理增加了3.49%，較NE處理增加了1.52%，這是由于施入納米碳增效肥料可以提高可見熒光富里酸區域的物質相對含量，從而達到提高土壤腐殖化程度的作用。嫩江試驗區的T2處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.73，比CK處理增加了5.81%，較NE處理增加了1.87%；愛輝試驗區的T2處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.70，比CK處理增加了4.65%，較NE處理增加了2.66%，這是由于沸石材料屬于高表面活性礦物，沸石對土壤和水體中的營養元素有較好的吸附作用，并能調節土壤顆粒結構改善理化性質，是營養元素良好的滯留場所，所以沸石包膜肥料較普通無機肥料可以有效延緩腐殖物質隨雨水流失，使FA等腐殖物質儲存在土壤中。嫩江試驗區的T3處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.69，比CK處理增加了4.26%，較NE處理增加了0.37%；愛輝試驗區的T3處理的PⅤ，n/PⅢ，n為2.65，比CK處理增加了2.71%，較NE處理增加了0.76%，這是因為生物炭疏松多孔的結構使其具有很強的吸附和持水能力，所以施加生物炭增效肥料有利于提高土壤的持水能力和有機質的積累[11-12]。

表2 嫩江不同施肥處理下土壤FA的熒光參數Table 2 Fluorescence parameters of different fertilization treatments of fulvic acid in Nenjiang

表3 愛輝不同施肥處理下土壤FA的熒光參數Table 3 Fluorescence parameters of different fertilization treatments of fulvic acid in Aihui

圖1 不同處理FA的去散射圖Fig.1 Descattering diagram of fulvic acid treated with different fertilizers

以上數據能夠說明T1，T2以及T3增效處理均可提高土壤FA腐殖化程度。根據FA傳統熒光圖譜分析表明，與CK處理相比，施用幾種增效肥料可增加土壤FA的腐殖化程度，對于提高土壤FA的腐殖化程度的作用表現為：T2增效處理>T1增效處理>T3增效處理。土壤FA主要是通過施加肥料所產生的，其熒光特性主要與FA中的結構特性有關，FA中的苯環的數量和官能團往往會對其熒光特性有影響，其中三種增效肥料均能夠不同程度提高土壤腐殖化的程度。

有研究結果表明[15]，r(A,C)為紫外區與可見光區FA熒光強度的比值，r(A,C)越大，土壤FA的芳構化程度越低。嫩江NE處理、CK處理、T1處理、T2處理、T3處理的r(A,C)值分別是0.372，0.387，0.371，0.364，0.371；愛輝NE處理、CK處理、T1處理、T2處理、T3處理的r(A,C)值分別為0.380，0.389，0.374，0.371，0.378。由此可知，不同試驗地點下不同施肥處理的土壤FA結構復雜程度均表現為T2處理結構較復雜，T1處理和T3處理次之，以上3種增效處理的土壤FA結構復雜程度均大于NE處理，CK處理結構最為簡單。其中嫩江試驗區T2增效處理的r(A,C)值較CK處理降低了1.89%;愛輝試驗區T2增效處理的r(A,C)值較CK處理降低了4.63%。施用三種增效肥料均能提高土壤FA組內的復雜程度，從而延緩土壤中富里酸的消耗，有利于土壤肥力的保持，因此施用增效肥料對于土壤肥力的保持作用是顯而易見的。

2.2 不同新型肥料處理的平行因子分析

根據平行因子分析方法(PARAFAC)，將土壤FA分為C1、C2熒光組分，其中C1組分類富里酸；C2組分類胡敏酸。

平行因子分析方法識別出不同肥料處理的土壤FA均含有2個熒光組分。從圖2可知，嫩江和愛輝試驗區C1組分中均具有1個最大發射峰、2個最大激發峰，Ex/Em的波長均為230，320/410 nm。嫩江和愛輝試驗區C2組分均具有1個最大發射峰、1個最大激發峰，Ex/Em的波長均為265/465 nm。由于C1組分的生物可利用性較高，因此可作為肥力供給的重要依據，其中C1組分的特征峰(Ex/Em：230/410 nm)，與A峰(Ex/Em<250/412 nm)十分接近，可用來表示腐殖質類物質[16]，特征峰(Ex/Em：320/410 nm)，位于傳統C峰(Ex/Em：345/433 nm)、M峰(Ex/Em：325/385 nm)區域范圍內，可能與構成FA分子的羰基和羧基有關。各處理C2組分為陸生來源FA組分，該組分對于改善土壤理化特性、促進團聚體形成具有顯著的作用。從圖2可知，嫩江、愛輝試驗區C2組分均具有1個最大激發峰和1個最大發射峰，嫩江、愛輝試驗區的C2組分Ex/Em均為265/465 nm，在傳統A峰上方區域，能夠表示氨基酸類腐殖物質。

圖2 不同施肥處理的熒光組分光譜圖Fig.2 Fluorescence component spectra of different fertilization treatments

2.3 不同肥料處理Fmax值差異分析

不同肥料處理Fmax相對含量的變化如圖3、圖4所示，各肥料處理間的平行因子分析方法識別出各組分相對含量說明各試驗區域土壤FA以C1組分為主，C2 組分為輔。

圖3 嫩江不同施肥處理下富里酸各熒光組分對應Fmax值Fig.3 Fmax values of each fluorescent component of fulvic acid treated with different fertilizers in Nenjiang

圖4 愛輝不同施肥處理下富里酸各熒光組分對應Fmax值Fig.4 Fmax values of each fluorescent component of fulvic acid treated with different fertilizers in Aihui

T1增效處理、T2增效處理、T3增效處理的C1、C2組分均照CK處理的C1和C2組分有所增加，嫩江與愛輝試驗區FA的C1和C2組分Fmax值如圖3、圖4所示。C2組分相對含量越高，土壤腐殖化程度就越高。嫩江試驗區NE，CK，T1，T2以及T3處理的C2組分所占比例分別為53.98%，46.36%，50.52%，51.20%和47.71%；愛輝試驗區NE，CK，T1，T2以及T3處理的C2組分所占比例分別為53.91%，46.23%，50.44%，51.08%和47.58%，由此，嫩江試驗區與愛輝試驗區土壤腐殖化程度均表現為NE處理>T2處理>T1處理>T3處理>CK處理。其中T2增效處理在嫩江試驗區的PⅤ，n/PⅢ，n較CK處理提高了5.81%，C2/C1較CK處理提高了22.09%；T2增效處理在愛輝試驗區的PⅤ，n/PⅢ，n較CK處理提高了4.65%，C2/C1較CK處理提高了20.93%。其中T1增效處理采用的是納米碳增效劑，T1增效處理誤差偏大可能是由于所選用的液體納米碳在實驗室條件下對肥料包膜的過程中納米碳包膜不均勻造成的。結合FA的平行因子分析結果可證實，與CK處理相比，施用增效肥料增加了FA中的生物利用組分和陸生源FA類物質，表明FA中腐殖化水平、芳香度較高的組分對于土壤生態環境的改善有著積極的作用。

2.4 熒光組分與參數的相關性分析

通過SPSS對C1和C2兩個組分和相關參數進行相關性分析。FI代表熒光指數，當FI<1.4時，DOM異源特征明顯；當FI在1.4～1.9之間時，表示DOM是生物和非生物的混合液；當FI>1.9時，表明DOM來自于微生物代謝活動。BIX代表DOM的自生源參數，反映了自生源有機物對土壤DOM的貢獻。FI和BIX均是指示DOM來源的指標，FI和BIX越大，越有可能是自生源產生；反之，越可能是外源輸入。其中，嫩江試驗區的FI值為1.60，BIX值為0.71；愛輝試驗區的FI值為1.57，BIX值為0.73。由表4可知，C1和C2組分與FI和BIX均為負相關關系，說明土壤FA的兩種組分有著相同的來源，平行因子分析所得到的C1和C2組分，均與陸源有機物質有關。

表4 C1和C2組分的Fmax與FI和BIX的相關性Table 4 Correlation between Fmax value of C1， C2 component and FI， BIX

3 結 論

(1)根據三維熒光區域積分方法以及不同肥料處理區域Fmax相對含量的變化，五個施肥處理中，T2增效處理對于提高土壤腐殖化程度，提高土壤的供肥水平表現最為顯著。根據五個處理的比較結果顯示，Fmax值表明，T2增效處理有效增加FA中C2組分。

(2)不同處理條件下土壤FA包含兩種熒光組分，C1組分為類富里酸，C2組分為類胡敏酸；根據差異性分析結果顯示，平行因子分析所得到的C1和C2組分的Fmax值與FI和BIX呈現出負相關關系，說明土壤FA的來源均與陸源有機物質有關。

(3)與CK處理相比，T1，T2和T3三個增效處理均對提高土壤供肥能力具有積極作用，其中T2增效處理的提升作用最為明顯，采用沸石作為肥料增效劑對于土壤FA的積極作用要優于納米碳和生物炭。利用增效劑對肥料表面進行包膜可以延長肥料的肥效和降低肥料的淋溶損失，沸石材料作為包膜肥料膜材料的一種，來源廣泛且成本低廉，沸石材料內部孔隙較多、孔隙較大，沸石材料相較于納米碳和生物炭有更大的比表面積，使用沸石材料包膜肥料能夠為微生物提供良好的居留場所，促進微生物活動，進一步提高土壤FA水平，通過沸石材料包膜肥料對于增加沸石材料的應用方向以及包膜肥料膜材料的選擇具有一定的指導意義，并且能夠增加土壤腐殖化的程度。