血清PS-PLA1水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)相關(guān)性分析

曾 君 李時(shí)飛 周小芳 汪 婷 宋志強(qiáng) 翟志芳

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶，400038

SLE是一種病因尚未明確可累及多器官系統(tǒng)的自身免疫性疾病。目前已知機(jī)體細(xì)胞凋亡加速，凋亡細(xì)胞的清除缺陷是其重要的發(fā)病機(jī)制之一。近年來研究[1]顯示PS-PLA1通過特異性水解磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)影響凋亡細(xì)胞的清除，在SLE發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測(cè)并比較SLE患者與健康對(duì)照組PS-PLA1表達(dá)差異，及其與SLE疾病活動(dòng)的相關(guān)性，旨在探討PS-PLA1在SLE疾病活動(dòng)評(píng)價(jià)中的價(jià)值，為臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年1～12月就診于我院的SLE患者101例，男7例，女94例，平均年齡(37.009±12.527)歲。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例診斷明確，SLE診斷參照1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)[2]，狼瘡腎炎定義參照2019年中國狼瘡腎炎診斷指南[3]。②臨床病歷資料完整。患者排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤、妊娠、原發(fā)性肝腎疾病、感染性疾病及其它自身免疫性疾病。收集同期健康體檢者85例，男4例，女81例，平均年齡(38.514±11.378)歲。兩組年齡和性別均無明顯差異。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料與分組 收集SLE患者臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：基本信息包括性別、年齡、病程等；臨床表現(xiàn)包括特異性皮疹(包括蝶形紅斑、DLE、SCLE以及ACLE皮損)、黏膜潰瘍、脫發(fā)、光過敏、關(guān)節(jié)痛等；實(shí)驗(yàn)性指標(biāo)包括血常規(guī)如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)；尿常規(guī)如血尿、蛋白尿；血生化如血肌酐、血尿酸、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶；補(bǔ)體(C3，C4)及CRP；自身抗體譜如抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗心磷脂抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體和抗U1-RNP抗體等。根據(jù)SLEDAI評(píng)分對(duì)患者疾病活動(dòng)進(jìn)行分組[4]：穩(wěn)定組31例(SLEDAI 0～4分)，輕度活動(dòng)組45例(SLEDAI 5～9分)，中重度活動(dòng)組25例(SLEDAI ≥10分)；同時(shí)以SLEDAI 5～9分為低度活動(dòng)組(45例)，SLEDAI≥10分為高度活動(dòng)組(25例)。

1.3 PS-PLA1檢測(cè) 收集SLE患者及健康對(duì)照組空腹外周靜脈血2 mL，室溫下自然凝固15 min，離心機(jī)(德國eppendorf 5810R)離心20 min(2500 r/min)，仔細(xì)收集上清。PS-PLA1檢測(cè)ELISA試劑盒(江蘇晶美公司)采用雙抗體夾心法按照試劑盒具體操作步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各組血清中PS-PLA1水平，用酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD iMark)MPM6.0軟件在450 nm波長下測(cè)定吸光度(OD值)，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本中PS-PLA1含量。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者臨床資料比較 101例SLE患者，穩(wěn)定組31例，活動(dòng)組(包括輕、中重活動(dòng)組)70例。穩(wěn)定期患者臨床表現(xiàn)如特異性皮疹、關(guān)節(jié)痛、黏膜潰瘍、脫發(fā)、光過敏、血尿、蛋白尿的發(fā)生率均顯著低于活動(dòng)組(均P<0.05)。穩(wěn)定組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如補(bǔ)體C3、C4顯著高于活動(dòng)組(P<0.05)；穩(wěn)定組患者血尿酸值、抗dsDNA抗體和抗SM抗體陽性率顯著低于活動(dòng)組(P<0.05)。兩組間白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)、血肌酐、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗心磷脂抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體、抗U1-RNP抗體陽性率均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 血清PS-PLA1的表達(dá) SLE患者血清中PS-PLA1(35.555±10.098)ng/mL明顯高于健康對(duì)照組(26.416±9.785)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.236，P<0.001)。穩(wěn)定組PS-PLA1(29.532±8.194)ng/mL明顯低于活動(dòng)組(38.222±9.752)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.328，P<0.001)。穩(wěn)定組PS-PLA1與輕度活動(dòng)組(34.790±8.854)ng/mL、中重度活動(dòng)組(44.398±8.238)ng/mL三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.459，P<0.001)；組間比較均有顯著差異(P值分別為0.009，<0.001，<0.001)。低度活動(dòng)組PS-PLA1(34.790±8.854)ng/mL明顯低于高度活動(dòng)組(44.398±8.238)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.457,P<0.001)，見圖1。

注：*P、**P和***均P<0.001

圖1 SLE患者不同疾病活動(dòng)性組間PS-PLA1表達(dá)差異

本組研究中狼瘡腎炎患者23例，非狼瘡腎炎患者78例。狼瘡腎炎組血清中PS-PLA1表達(dá)水平(37.365±11.815)ng/mL高于非狼瘡腎炎組PS-PLA1(35.176±9.430)ng/mL，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.922，P=0.359)。

表1 SLE患者臨床資料和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的組間差異比較

2.3 SLE患者PS-PLA1水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和SLEDAI評(píng)分的相關(guān)性 各單因素實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在SLE穩(wěn)定期與活動(dòng)期的差異分析顯示，P值<0.05的指標(biāo)分別為PS-PLA1、血尿酸、C3、C4、CRP、抗dsDNA抗體和抗Sm抗體，將上述變量納入多元線性回歸模型，校正混雜因素后的得出PS-PLA1、C3、CRP是SLE病情活動(dòng)的獨(dú)立相關(guān)因素(表2)。

血清中PS-PLA1水平與C3、C4呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.318，P=0.001；r=-0.204，P=0.041)；與CRP、抗dsDNA抗體和SLEDAI評(píng)分呈明顯正相關(guān)(r=0.262，P=0.008；r=0.231，P=0.020；r=0.526，P<0.001)(圖2)；血清中PS-PLA1水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)等無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 SLEDAI評(píng)分與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的多元線性回歸分析

2.4 PS-PLA1與SLE疾病活動(dòng)相關(guān)性的敏感性與特異性 PS-PLA1預(yù)測(cè)SLE疾病活動(dòng)高低程度的ROC曲線結(jié)果顯示：曲線下面積(AUC)為0.788，SE=0.054，95%CI=0.682～0.894，最佳臨界值為0.467，PS-PLA1水平≥39.121 ng/mL時(shí)，敏感性為80.0%，特異性為66.7%，P<0.0001(圖3a)。PS-PLA1診斷SLE的ROC曲線結(jié)果顯示：AUC為0.739，SE=0.036，95%CI=0.669～0.810，最佳臨界值為0.427，PS-PLA1水平≥31.670 ng/mL時(shí)，敏感性為71.300%，特異性為71.400%，P<0.0001(圖3b)。

圖2 SLE患者PS-PLA1表達(dá)水平與C3、C4、CRP和SLEDAI評(píng)分相關(guān)分析

3a:PS-PLA1評(píng)價(jià)SLE疾病活動(dòng)性的ROC曲線;3b:PS-PLA1診斷SLE的 ROC曲線

3 討論

SLE是一種可以累及皮膚、腎臟、關(guān)節(jié)等多器官系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)多種多樣，預(yù)后差，死亡率高[5]。目前研究認(rèn)為SLE是在遺傳和環(huán)境因素相互作用下機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)異常[6]，機(jī)體細(xì)胞凋亡加速，凋亡細(xì)胞清除機(jī)制受損，暴露的自身抗原誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞激活Th1和Th2細(xì)胞促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體和多種細(xì)胞因子，形成免疫復(fù)合物，最終導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥和多器官損傷[7-9]。臨床上，SLE疾病活動(dòng)評(píng)價(jià)主要采用SLEDAI評(píng)分、BILAG量表、ECLAM評(píng)分、SLAM評(píng)價(jià)體系等對(duì)疾病的活動(dòng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，但因其相對(duì)繁瑣，臨床應(yīng)用受到一定限制。臨床上抗dsDNA抗體診斷SLE特異性高但敏感性低、CRP和C3診斷SLE敏感性高，但其干擾因素較多，對(duì)疾病活動(dòng)判斷的特異性較差。因此，探尋一個(gè)敏感性和特異性高、臨床檢測(cè)便捷的SLE病情活動(dòng)性評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)于臨床SLE的治療評(píng)價(jià)極其重要。

研究顯示SLE患者體內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯增多，胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在胞膜脂質(zhì)雙分子層的外葉，成為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，發(fā)出“Eat-Me”信號(hào)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞迅速吞噬降解凋亡細(xì)胞[10]。PS-PLA1是胰脂肪酶基因家族中磷脂酶A1(PLA1)的成員之一，對(duì)PS有嚴(yán)格的底物特異性，能夠在sn-1位點(diǎn)高效水解暴露于細(xì)胞膜外的PS并生成溶血磷脂酰絲氨酸(LysoPS)[11]，使巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別減弱，引起凋亡清除過程的延遲和受損[12]，提示PS-PLA1在凋亡缺陷機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，隨著對(duì)PS-PLA1的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌和黑素瘤中腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移[11，13]、丙型肝炎病毒復(fù)制[14]以及甲狀腺功能亢進(jìn)[15]等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮重要作用。

PS-PLA1血清水平升高一定程度上反映細(xì)胞凋亡清除缺陷引起的針對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)加重，因此，SLE患者PS-PLA1血清水平可以反映機(jī)體自身免疫性炎癥輕重程度。Sawada等[16]研究證實(shí)，161例SLE患者血清PS-PLA1明顯高于健康對(duì)照組，且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，治療后PS-PLA1水平明顯下降。本研究也獲得相似結(jié)果，而且SLE患者血清PS-PLA1血清水平與CRP、抗dsDNA抗體陽性率和SLEDAI評(píng)分呈顯著正相關(guān)，與補(bǔ)體C3和C4呈負(fù)相關(guān)。PS-PLA1對(duì)SLE疾病活動(dòng)高低評(píng)價(jià)的敏感性與特異性分別為80.0%、66.7%，對(duì)SLE診斷的敏感性與特異性分別為71.3%、71.4%。由此可見，PS-PLA1可望成為SLE診斷及病情評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。

近年研究顯示[17]動(dòng)脈粥樣硬化等心血管事件已逐漸成為SLE患者晚期死亡的主要原因之一。在動(dòng)脈內(nèi)膜脂蛋白異常沉積的基礎(chǔ)上，特異性的免疫異常在粥樣斑塊的形成與發(fā)展發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道[18]，PS-PLA1水解PS的產(chǎn)物L(fēng)ysoPS是一類新型的生物活性脂類，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子和趨化因子的表達(dá)、平滑肌細(xì)胞的遷移，亦能結(jié)合血小板表面高表達(dá)的LysoPS受體，活化血小板，可能參與SLE動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)病過程。因此，PS-PLA1的異常升高可能通過上述途徑間接參與SLE心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程。因我們收集患者樣本量偏差，合并心血管事件患者比例較少，故未能進(jìn)行相關(guān)性評(píng)價(jià)，需要我們后續(xù)進(jìn)一步深入探究。研究結(jié)果表明，PS-PLA1表達(dá)在狼瘡腎炎組與非狼瘡腎炎組無明顯差異，提示PS-PLA1作為指標(biāo)診斷SLE是否合并狼瘡腎炎的價(jià)值有限。

綜上，本研究表明SLE患者血清PS-PLA1水平顯著高于健康人群，且其表達(dá)水平與SLE疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，因此，血清PS-PLA1對(duì)評(píng)估SLE疾病活動(dòng)性具有重要價(jià)值，可能成為SLE臨床診斷及治療評(píng)價(jià)的潛在生物學(xué)標(biāo)志。由于本組研究樣本量有限，同時(shí)未能對(duì)患者進(jìn)行縱向隨訪評(píng)價(jià)，具有一定局限性，需要我們后期進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。