基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖傳感器的研究進展

劉 皓，喬巨濤，方 紓，劉越峰，李 倩

（1.天津工業大學紡織科學與工程學院，天津300387；2.天津工業大學智能可穿戴電子紡織品研究所，天津300387）

近年來，糖尿病的患病率持續增加，每年因糖尿病死亡的人口也在持續增高。糖尿病作為一種致死性的慢性疾病，目前還沒有有效的治愈手段。健康人的血糖水平通常在3.9～6.0 mmol/L，超出此范圍的葡萄糖濃度可能導致腎功能不全、糖尿病等[1]。而檢測血糖濃度作為診斷糖尿病的主要方法之一，其檢測準確性對于患者將血糖水平維持在正常的生理范圍內至關重要[2]。此外，監控血糖水平可以更好地了解人體的健康情況，從而可以通過早期診斷和治療來改善患者的健康狀況[3]。

葡萄糖傳感器是生物傳感器中研究最多的酶電極傳感器，它可以簡單并迅速地測定血糖，對糖尿病的診斷和治療有著重要的實際意義[4]。葡萄糖氧化酶（GOx）是葡萄糖生物傳感器研究中應用最廣泛的一種酶。GOx是一種特征明確的糖蛋白，由2個相同的80 ku亞基與2個黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔酶結合而成[5]。GOx可以催化D-葡萄糖（C6H12O6）氧化為D-葡萄糖酸內酯（C6H10O6）和過氧化氫（H2O2），從而實現對葡萄糖的高度特異性檢測。自1967年Updike和Hicks[6]報道了基于GOx的酶電極以來，在不斷增長的醫療保健需求的推動下，人們對基于GOx的葡萄糖生物傳感器進行了大量的研究，使得各種商業化的葡萄糖生物傳感器得到了發展和改進[7]。

基于前人的工作，本文對GOx在酶電極中的固定化方法進行分類總結，對不同固定化方法對傳感器性能的影響進行簡單分析，并從微創式、可植入式和無創式等3種葡萄糖的可連續監測形式方面對基于GOx的葡萄糖傳感器的最新研究進展進行了介紹。

1 GOx在酶電極中的固定化方法

自Müller從黑曲霉和青霉菌中分離出GOx以來，在葡萄糖生物傳感器的開發中GOx就被廣泛地研究與應用[4]。但是，由于GOx固有的熱和化學不穩定性，使其所制備的葡萄糖傳感器容易受到溫度、濕度、pH值和非生理化學物質的影響[8-9]。為了制備穩定性和重現性良好的葡萄糖傳感器，研究人員開發了不同的GOx固定化方法[10-11]。由于固定化方法和所用載體材料的性質將直接影響GOx的催化性能，從而間接影響葡萄糖傳感器的穩定性、靈敏度和選擇性等性能指標。因此，GOx的固定化是制備性能優良的葡萄糖傳感器的關鍵技術之一。

本文對研究中常用到的GOx固定化方法進行了分類，如圖1所示。

圖1 GOx在葡萄糖傳感器制備過程中的固定方法Fig.1 Fixation method of GOx in preparation of glucose sensor

1.1 物理固定化方法

1.1.1 吸附法

直接將GOx吸附在電極表面是一種比較簡單的固定化技術。采用吸附法制備葡萄糖傳感器時，一般將GOx溶液滴加到電極表面或者將電極浸入GOx溶液，GOx可通過靜電引力直接吸附于電極表面進行固定。采用吸附法固定GOx操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復使用。但由于酶只是通過物理吸附固定在電極表面，導致酶電極對溶液的pH值、離子強度和溫度等測試條件的變化比較敏感，因此，測試條件要求比較苛刻。此外，通過此方法固定的酶與電極結合不牢固，容易從電極表面脫落，使用壽命較短。

為解決上述問題，在采用吸附法固定GOx前，通常需要對電極表面進行處理，修飾一層可增強電極對GOx靜電吸附能力的物質。聚吡咯（PPy）由于具有良好的生物相容性，可以作為GOx的固定化基底。GOx可以在電化學的作用下吸附于PPy表面[12]，同時PPy的形貌和尺寸也會對GOx的固定量產生影響[13]，從而影響傳感器的靈敏度。金納米顆粒（Au NPs）也是一種常用的修飾電極的物質，對GOx產生吸附作用的同時其大比表面積還可以為GOx提供更多的附著位點，在基于GOx的葡萄糖生物傳感平臺的開發中受到廣泛的應用[14-17]。Zhou等[18]通過靜電吸附作用將GOx固定在Au NPs修飾的氧化鋅納米線（ZnO NWs）上構建了葡萄糖傳感器。Au NPs可以加速電子從GOx的氧化還原中心向ZnO NWs的轉移，從而明顯提高了電子的轉移速率，與無Au NPs的傳感器相比，該葡萄糖傳感器的靈敏度要高2.92μA/（mmol·L-1·cm2）。

1.1.2 包埋法

根據包裹材料的不同，包埋法又分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。以各種多孔凝膠為載體，將GOx包埋在凝膠微孔內的方法稱為凝膠包埋法；將GOx包埋在各種半透性聚合物制成的小球內的方法稱為半透膜包埋法。通過包埋法制備的酶電極對外界環境的緩沖作用大，可防止使用過程中酶體的機械損傷。

全氟磺酸（Nafion）是GOx固定化過程中最常用到的包埋材料，操作過程簡單，只需在GOx負載到電極表面后，用Nafion溶液將電極包裹干燥成膜即可[19-23]。Lee等[24]通過凝膠包埋法將二茂鐵（Fc）和GOx嵌入到溶膠-凝膠基質中制備了葡萄糖傳感器，并與殼聚糖膜包埋Fc和GOx的電極進行對比，其表觀米氏常數（Km）增大了10.92 mmol/L，對葡萄糖的最大響應電流達到7.52μA。Dhanjai等[25]制備了一種新型的葡萄糖催化納米膠囊（nGOx），通過原位聚合的方法在GOx周圍形成了一層薄薄的聚合物層，聚合物外殼有效地穩定了GOx核心，在不影響生物催化活性的同時對溫度和有機溶劑表現出良好的耐受性。

1.1.3 混合法

混合法主要是通過將GOx與電極修飾材料進行簡單混合后再固定到電極表面的固定化方法。混合法常被用于多種酶協同作用的生物傳感器。Santana等[26]通過將GOx和辣根過氧化物酶（HRP）的混合物固定到紙基上，制備了一種可用于唾液中葡萄糖檢測的傳感器。通過掃描儀分析性能，結果顯示檢測限為0.37 mg/dL（S/N=3），線性范圍為1～22.5 mg/dL（R2=0.992 35）。Bagal等[27]將蔗糖酶（Inv）、多壁碳納米管（MWCNTs）、鉑納米顆粒（PtNPs）和GOx與溶膠-凝膠溶液進行混合，制備出新型酶納米復合材料，通過絲網印刷對碳電極（SPCE）進行修飾，研制了一種電化學生物傳感器。該傳感器對蔗糖的響應時間低于3 s，在1×10-9～1×10-4mol/L的線性檢測范圍內靈敏度為3.109μA/（mmol·L-1·cm2）（R2=0.998），檢出限（LOD）低至1×10-9mol/L（S/N=3）。這種方法的制備工藝相對簡單，但是由于酶分布不均勻并且容易泄露，所以目前應用較少。

1.2 化學固定化方法

1.2.1 共價法

共價法是通過GOx的非活性基團與載體形成不可逆的連接，即酶具有的羧基和氨基之類的官能團與載體官能團之間形成共價鍵，從而使GOx固定在電極表面。采用該方法制備酶電極的過程操作復雜，控制條件苛刻，但GOx與載體之間結合緊密，不易脫落，穩定性好，因此，常被科研工作者使用。

1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）是GOx共價固定化過程中最常用到的活化劑。Kim等[28]在EDC和NHS的混合溶液中，激活聚丙烯酸叔丁酯（pTBA）層上的苯甲酸基團，與GOx形成共價鍵用于固定酶，從而制備出一次性葡萄糖傳感器，該傳感器對葡萄糖的檢測范圍為30～500 mg/dL，檢測限低至（17.23±0.32）mg/dL。

Debasis等[29]通過將MWCNT胺基官能團化制備了胺端基多壁碳納米管（NH2-MWCNTs），可與GOx的羧基形成共價鍵用于共價固定GOx。Matysiak等[30]對還原氧化石墨烯（rGO）進行修飾，制備rGO-Fc（COOH）2生物活性平臺，rGO-Fc（COOH）2的羧基和GOx的胺基之間可形成酰胺鍵，通過共價法將GOx固定在生物活性平臺上，制備了GC/rGO-Fc（COOH）2/GOx生物傳感器。該傳感器在1～10μmol/L和20～100 μmol/L的2個葡萄糖濃度范圍內呈線性變化，在脫氧和氧氣飽和的磷酸鹽（PBS）緩沖液中的檢測限分別為0.04μmol/L和0.02μmol/L。

1.2.2 交聯法

交聯法是在共價法基礎上進行的改進，依靠雙功能團試劑在GOx與載體、GOx分子之間形成橋接，從而交聯成網狀結構使酶固定化。通過交聯法制備的酶傳感器能構建起酶與電極之間的直接電子轉移，有效地加快電子轉移速率。GOx在固定過程中最常用到的交聯劑是戊二醛[31-33]，它能在較溫和條件下與酶的基團發生反應。Chaichi等[32]成功制備了天然高分子殼聚糖包覆的磁性Fe3O4納米顆粒，然后通過戊二醛將GOx以共價鍵鏈接固定在其表面，構建了一種基于化學發光（CL）檢測酶法生成H2O2的新型高效葡萄糖生物傳感器。該生物傳感器線性檢測范圍為0.85×10-3～100μmol/L（R2=0.995 6），檢測限為0.43μmol/L，相對標準偏差小于3.1%。

雖然通過交聯法制備的葡萄糖傳感器具有良好的穩定性，但交聯劑的用量通常會對電極的活性產生較大的影響。Fang等[34]采用交聯-包埋相結合的方法開發了一種能連續監測皮下葡萄糖的微創葡萄糖生物傳感器。測試結果表明，當儲存在37℃的牛血清中時，傳感器的靈敏度在最初的13 d內逐漸增加約30%的初始值，然后在余下53 d的研究期間保持穩定，但該傳感器在PBS和牛血清檢測中均顯示出較低的靈敏度（63 nA/（mmol·L-1·cm2））。

1.2.3 電化學聚合法

電化學聚合法是在聚合單體的過程中將GOx嵌入聚合物膜中的酶固定化方法。通過將GOx、聚合單體等加入同一溶液體系，在恒電位法等氧化或還原方法下聚合到裸電極上，聚合過程中GOx通過靜電或吸附作用嵌入聚合物薄膜從而被固定。常用的聚合物單體有吡咯和苯胺等。該方法制備酶電極可通過一步法完成，并且具有較好的重現性。

Xu等[35]報道了一種基于高深寬比碳柱微陣列的葡萄糖傳感器的設計和制備方法。首先采用碳微機械系統（C-MEMS）技術制備碳柱微陣列，然后通過共沉積GOx和電化學聚合PPy將GOx固定在碳電極上，從而制備葡萄糖傳感器。對不同樁高、不同樁密度的葡萄糖傳感器的傳感性能進行測試和比較，實測結果與模擬結果相當。Wu等[36]以GOx為囊材，采用一步電聚合法制備了聚磺基-3，4-亞乙基二氧噻吩（PSBEDOT）包封GOx的葡萄糖生物傳感器。PSBEDOT為GOx的固定化提供了一個很好的平臺，同時PSBEDOT-GOx的抗污染、高靈敏度和長期穩定性使其成為一個有前途的長期、連續血糖監測平臺。

1.3 物理固定與化學固定方法比較

整體來說，不同的固定化方法都有各自的優缺點。物理固定化方法操作簡單、對設備要求低、條件溫和、對酶的活性損傷小，但容易造成固定不牢固，測試過程中酶容易在電極表面脫落，即便通過包埋法將酶包埋到傳感器內部以減少酶脫落，又會造成酶難與溶液接觸，酶的利用率較低。化學固定化方法雖然可以將酶牢固地固定在電極表面，但固定化過程中的溶液環境以及形成的價鍵結構容易破壞酶的活性，從而損失傳感器的傳感性能；化學固定化方法對設備要求較高，反應過程難于控制。本文根據固定化方法對文獻中基于GOx的葡萄糖傳感器的性能進行總結，如表1所示。由表1可知，通過化學固定化方法所制備的葡萄糖傳感器通常要比物理固定化方法所制備的葡萄糖傳感器具有較高的檢測范圍和穩定性。目前，研究工作者已經開始使用物理和化學相結合的固定化方法，在提高酶的固定率的同時，盡可能地保證酶的活性。

表1 GOx的葡萄糖傳感器中的固定化方法及傳感器性能Tab.1 Immobilization methods of GOx in glucose sensor and performance of glucose sensor

2 GOx基葡萄糖傳感器的持續監測形式

近年來，柔性電子產品由于其在可穿戴設備和生物醫學設備中的巨大潛力而受到廣泛關注[47-48]，其中柔性生物傳感器在便攜式醫療產品、微創植入式設備和緊湊型診斷平臺的開發中具有相當大的應用價值[49-50]。葡萄糖作為人類健康和代謝狀態的重要指標，針對葡萄糖檢測的柔性葡萄糖傳感器得到了廣泛關注[51]。目前，市場上最常用的血糖監測系統為通過手指穿刺采集血液的一次性設備[52]，但這種測試方法無法對患者進行24 h連續有效的血糖監控。此外，通過手指穿刺取血可能會帶來明顯的疼痛感，長期的檢測易使患者造成抗拒心理，同時，刺破取血傷口若處理不好，容易造成傷口感染[53]。因此，開發一種無痛、柔性親和、可實時監測血糖水平的傳感器至關重要。目前，對于可持續監控的葡萄糖傳感器的開發主要集中在對細胞間質液（ISF）以及一些其他非血液的生理液體進行監測，根據其監測形式可分為微創式、植入式和無創式。

2.1 微創式

微創性葡萄糖檢測是在提高檢測準確性的同時減小皮膚損傷的一種有效途徑，主要以微針探頭的形式刺入皮膚，通過對ISF的葡萄糖水平的檢測來監測人體健康水平。這種傳感方法基于ISF和血液中葡萄糖水平之間可靠的相關性[54]。

Hwa等[55]制作了一個低成本、低功耗、使用方便的連續血糖監測系統。利用3-巰基丙酸（MPA）將GOx固定在金微針表面，制備皮下葡萄糖傳感器，可刺透皮膚上層從而檢測ISF中的葡萄糖水平，適用于實時連續血糖監測。Kim等[53]開發了一種用于人體血液葡萄糖監測的微創無線生物傳感器，如圖2所示，采用微針陣列和環狀烯烴共聚物制成傳感器探針，并通過共價鍵合和電聚合的方法將GOx固定在鍍金微針（AuMN）表面。最后，將傳感器部件耦合到可重復使用的無線發射器上，成功地將測量值通過無線發射器發送到移動電話，驗證了所提方法的可靠性。

圖2 微創式葡萄糖傳感器探頭制造示意圖Fig.2 Schematic representation of fabrication of minimally invasive glucose sensor probe

采樣和即時代謝產物讀數的整合可以從根本上提高患者的依從性。為了便于現場分析和護理點診斷，避免繁瑣的實驗室儀器測試，Wang等[56]利用GOx和辣根過氧化物酶（HRP）在異常高的葡萄糖水平下的級聯酶反應觸發3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺發生顯色反應，研制了一種集采樣、顯示于一體的透皮比色微針貼片。這種便攜式比色傳感器實現了對小鼠ISF的微創提取，并迅速將血糖水平轉換為可見的顏色變化，可以在不需要抽血的情況下檢測血糖水平。

2.2 植入式

目前，植入式酶電極傳感器是臨床上常用的連續血糖監測方法[57]。被植入的傳感器可動態測量皮膚ISF中不斷變化的葡萄糖水平，并可對不正常的血糖水平發出警報[58]。該監測方式避免了體外血液檢測的繁瑣步驟，例如采血和化學分析等[59]。Chen等[46]基于聚（3，4-亞乙基二氧噻吩）（PEDOT）修飾碳纖維微電極開發了一種植入式葡萄糖生物傳感器。由于碳纖維具備微尺寸（d=7μm）、體積小、機械強度高等優勢而成為可穿戴或可植入生物傳感器的優良電極。該傳感器儲存60 d后，靈敏度仍保持在初始值的81.3%。

可植入式生物傳感器所用材料需具有良好的生物相容性，為此，Li等[14]探究了GOx/AuNP/PEDOT（BSA）/Pt電極作為一種可移植、長效、靈敏的葡萄糖生物傳感器的潛力。該電極的生物相容性符合ISO109930-1標準。同時，通過連續7 d的葡萄糖測定，證實了該電極的穩定性，其偏差僅在5%左右。

能量供應問題也是植入式生物傳感器的瓶頸問題。為解決能量供應的限制，Zhang等[60]開發了一種自我供電植入式皮膚血糖計，用于實時檢測體內血糖水平。基于GOx@ZnO納米線的壓電-酶反應耦合作用，傳感器可主動輸出含有葡萄糖檢測信息的壓電信號。因為輸出的壓電電壓既可作為生物傳感信號，也可作為電能，所以,該裝置不需要外加電源或電池。在小鼠體內植入該裝置進行血糖檢測，結果證明，該設備成功地在小鼠體內進行工作并檢測血糖濃度的變化。

2.3 無創式

隨著可穿戴和移動技術的發展，無創式血糖監測平臺已經成為葡萄糖生物傳感器研發的重點[61-62]。無創監測主要是對除血液外的其它生理液體進行監測，因為生理液體中的葡萄糖含量都有一個固定的健康水平，并且每一個都與特定的葡萄糖濃度范圍有關。目前，在研究中常被用于檢測葡萄糖水平的生理液體主要有間質液[63]、汗液[64]、唾液[65]、尿液[66]和眼淚[67]等。

由Glikfeld等[68-69]開發的反向離子電泳技術已被用于生物傳感器進行無創血糖監測，通過皮膚的小電流可以吸引葡萄糖到表皮表面進行檢測。水凝膠因為具有良好的生物相容性，可以直接貼合到皮膚表面，同時也可作為GOx的保護層，在生物傳感器的研究中受到廣泛關注。Kim等[70]以檸檬酸為交聯劑，制備了葡萄糖響應型聚乙烯醇/β-環糊精（PVA/β-CD）水凝膠。GOx被物理固定在β-CD腔中，通過反向離子導入以精確檢測間質液中的葡萄糖水平，檢測限低至1 mmol/L，并且證明了水凝膠具有良好的吸水率和柔韌性，具備作為無創血糖監測的貼片傳感器的發展潛力。

對汗液中葡萄糖水平的檢測是目前無創式葡萄糖傳感器中研究較多的檢測方法。Kim等[71]基于透明質酸-金納米粒子/葡萄糖氧化酶（HA-AuNP/GOx）復合物開發了一種小型無線貼片型葡萄糖傳感器，可用于汗液的無創實時葡萄糖監測，如圖3所示。該傳感器具有水分蒸發慢（0.11μL/min）、響應快（5 s）、靈敏度高（12.37μA·dL/（mg·cm2））、低檢測限（0.5 mg/dL）和活性穩定（14 d）的優點。HA-AuNP/GOx復合物中的HA能夠使AuNP/GOx復合物均勻、穩定地分布而不發生聚集，并通過保持汗液和防止GOx與汗液中其他成分的非特異性相互作用，從而精確測量血糖水平。

圖3 無創式葡萄糖傳感器系統的示意圖以及用于無創實時監測汗液中葡萄糖的葡萄糖傳感機制Fig.3 Schematic illustration of noninvasive glucose sensor system，glucose-sensing mechanism for noninvasive real-time monitoring of glucose in sweat

Cui等[72]利用熒光共振能量轉移（FRET）效應研發了一種基于比例熒光納米雜化的可穿戴皮膚墊，實現了對汗液葡萄糖的無創和可視化監測。當皮膚墊附在身體上時，GOx催化汗液中的葡萄糖氧化產生H2O2，可促進熒光物質的衰減和恢復，從而使熒光從紅色變為藍色。這種視覺熒光變化的動力學（紅色→藍色）與汗液葡萄糖的濃度成正比。通過使用自己開發的可視化方法對糖尿病患者和健康志愿者進行臨床測試，診斷結果與通過商用血糖儀進行血糖檢測獲得的結果一致，表明該方法具備對生理狀態進行無創、半定量追蹤的潛力。

目前，無創式葡萄糖傳感器的研究越來越深入，特別是對汗液中葡萄糖的監控已經向著多種傳感器集成的方向發展。在未來，還需科研工作者在生物親和材料、傳感穩定性和組件集成小型化的方面付出努力。

3 總結及展望

隨著可穿戴技術的快速發展，智慧醫療的設想成為現實。血糖監控作為智慧醫療的重要組成部分，開發一種可對血糖水平進行有效監控的葡萄糖傳感平臺顯得尤為重要。本文綜述了基于GOx的葡萄糖傳感器的最新研究進展，對GOx的固定化方法進行了分類總結，根據其監測形式和監測時對患者的損傷程度對可持續監測的葡萄糖傳感器進行了分類，并對其最新的研究進展進行了詳細的介紹。目前，可持續監控的葡萄糖傳感器正向著柔性化、小型化、便攜化、智能化的方向發展，在可穿戴領域展現出良好的發展前景。

盡管葡萄糖生物傳感器的研究已經取得了不錯的進展，但嚴格控制糖尿病的前景尚未實現，要實現高度穩定、可靠的連續血糖監測仍存在許多挑戰和障礙，在應用過程中需要考慮生物相容性、小型化、長期穩定性、校準、安全性和方便性等多種因素。顯然，在這個方向上取得突破還需要對基本的生物化學、生理學、電化學和材料化學有詳細的了解。如今，準確可靠的血糖監測系統的發展有了巨大的進步，但要在現實應用中開發一個準確的系統還需要克服許多挑戰。在未來的研究中，構建具有實時有效、長久監測、生物親和的葡萄糖傳感器還需在GOx的固定化方法、材料的選用和封裝集成等技術方面尋找突破點，使血糖監控朝著柔性舒適、無創持續和信號即時傳輸的一體化方向發展。此外，系統集成也是生物傳感器技術中最關鍵的挑戰之一。如果這些難題都被克服，生物傳感器就可以從研究領域走向臨床領域。因此，在未來一段時間里，生物傳感器將是一個非常有前途的研究領域，而且對糖尿病的精確、方便地監測和控制也將在不久的將來成為現實。