柴胡皂苷D調控VEGF/VEGFR2信號通路抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲

沈波 張浩 毛爽 王立斌 李雪薇

【摘要】 目的：探討柴胡皂苷D（SSD）對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其對VEGF/VEGFR2信號通路的調控作用。方法：體外培養人非小細胞肺癌細胞A549，分別加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）的SSD處理48 h，記作SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組，分別將pcDNA、pcDNA-VEGF轉染至A549細胞后加入SSD處理細胞（SSD-H+pcDNA組、SSD-H+pcDNA-VEGF組）;采用CCK-8法與平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力;采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移及侵襲能力;檢測葡萄糖消耗、乳酸水平;采用Western blot法檢測VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量。結果：與Con組比較，SSD可明顯降低細胞活力與葡萄糖消耗、乳酸水平及N-cadherin、Vimentin、VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平（P<0.05），減少克隆形成數、遷移及侵襲細胞數（P<0.05），提高E-cadherin蛋白水平（P<0.05）。與SSD-H+pcDNA組比較，轉染pcDNA-VEGF可明顯提高細胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平（P<0.05），增加克隆形成數、遷移及侵襲細胞數（P<0.05），降低E-cadherin蛋白水平（P<0.05），提高VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平（P<0.05）。結論：柴胡皂苷D可通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路的激活從而抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

【關鍵詞】 柴胡皂苷D VEGF/VEGFR2信號通路 非小細胞肺癌 增殖 遷移 侵襲

[Abstract] Objective： To explore the effect of Saikasaponin D （SSD） on the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells and its regulation on VEGF/VEGFR2 signaling pathway. Method： Human non-small cell lung cancer cells A549 were cultured in vitro and SSD-treated 48 h， writed for SSD-L group， SSD-M group， and SSD-H group with different concentration （5， 10， 20 μmol/L） were added respectively. pcDNA and pcDNA-VEGF were transfected into A549 cells and SSD-treated cells， writed for SSD-H+pcDNA group， SSD-H+pcDNA-VEGF group were added into the A549 cells. CCK-8 assay and plate clone formation assay were used to detect the proliferation ability of cells. Transwell chamber assay was used to detect cell migration and invasion ability. Glucose consumption and lactic acid levels were detected. The protein expression levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， E-cadherin， N-cadherin and Vimentin were detected by Western blot. Result： Compared with Con group， SSD significantly decreased cell viability， glucose consumption， lactate level and protein levels of N-cadherin， Vimentin， VEGF， VEGFR2， p-MEK and p-ERK （P<0.05）， decreased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， and increased the protein level of E-cadherin （P<0.05）. Compared with SSD-H+pcDNA group， pcDNA-VEGF transfection significantly increased cell viability， glucose consumption and lactate levels （P<0.05）， increased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， decreased the protein levels of E-cadherin （P<0.05）， and increased the protein levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， N-cadherin and Vimentin （P<0.05）. Conclusion： Saikasaponin D can inhibit the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells by inhibiting the activation of VEGF/VEGFR2 signaling pathway.

[Key words] Saikasaponin D VEGF/VEGFR2 signaling pathway Non-small cell lung cancer Proliferation Migration Invasion

First-authors address： Peoples Hospital of Shenyang Economic and Technological Development Zone， Shenyang 110000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.08.006

肺癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一，我國肺癌發病率逐年上升，其中非小細胞肺癌占據肺癌的80%左右，已嚴重影響患者的生活質量，目前肺癌的治療手段已取得明顯進步，但患者的5年生存率仍然較低，且患者預后仍然很差，其主要原因在于肺癌細胞的高度遷移及侵襲能力[1]。因而如何抑制非小細胞肺癌細胞轉移成為研究重點。中草藥及其提取物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，既往研究顯示，部分中草藥可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲，并可有效減緩腫瘤發展進程，但關于其作用機制尚未闡明[2-4]。柴胡皂苷D（Saikasaponin D， SSD）是柴胡的主要活性成分，且具有抗癌作用[5]。但關于柴胡皂苷D對非小細胞肺癌的抑制作用及其可能作用機制尚未闡明。腫瘤血管生成主要包括內皮細胞增殖、遷移、基底膜降解等，其中血管內皮生長因子（VEGF）與血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）屬于促血管生成因子，并可促進內皮細胞增殖及遷移，從而促進肺癌等腫瘤發生及發展[6]。但柴胡皂苷D是否通過調控VEGF/VEGFR2信號通路而發揮抗肺癌作用尚未可知。因此，本研究于2019年1月-2020年2月主要探討柴胡皂苷D對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對VEGF/VEGFR2信號通路的調控作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 柴胡皂苷D購自美國Sigma公司;人非小細胞肺癌細胞A549購自美國ATCC細胞庫;葡萄糖消耗與乳酸水平檢測試劑盒購自美國BioVision公司;DMEM培養基與FBS購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;pcDNA3.1購自上海遠慕生物科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自南京固與生物有限公司;Transwell小室購自南京迅貝生物科技有限公司;Matrigel基質膠購自武漢安特捷生物技術有限公司;兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自美國Santa Cruz公司;兔抗人VEGF、VEGFR2抗體購自美國Abcam公司;兔抗人p-MEK、p-ERK抗體購自美國CST公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 A549細胞常規培養，待細胞生長融合度達到80%時進行傳代培養。取對數生長期A549細胞接種于96孔板（5×103個/孔），分別加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）的柴胡皂苷D處理48 h[7]，分別記作SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組。分別將pcDNA、pcDNA-VEGF轉染至A549細胞，加入含有濃度為20 μmol/L柴胡皂苷D的培養基培養48 h，分別記作SSD-H+pcDNA組、SSD-H+pcDNA-VEGF組。同時將正常培養的細胞作為Con組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取各組對數生長期A549細胞接種于96孔板（1×104個/孔），每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，應用酶標儀檢測波長在450 nm處的光密度值（OD值）。實驗重復3次，每組實驗設置3個復孔。

1.2.3 平板克隆形成實驗 取各組A549細胞接種于6孔板（1×103個/孔）中，置于培養箱繼續培養，每隔2 d更換一次培養液，直至出現肉眼可見的細胞克隆，培養時間為14 d，棄培養液，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定15 min，采用0.1%結晶紫染液染色20 min，洗滌，風干，應用熒光顯微鏡觀察克隆形成數。實驗重復3次，每組實驗設置3個復孔。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移及侵襲能力，遷移實驗與侵襲實驗相同實驗步驟：取各組A549細胞加入上室（3×104個/室），下室加入含有FBS的培養液（600 μL/室），置于培養箱繼續培養24 h，棄培養液，分別采用多聚甲醛固定與結晶紫染色液染色，應用顯微鏡觀察遷移及侵襲細胞數。不同之處：侵襲實驗前需稀釋Matrigel基質膠，將Matrigel基質膠稀釋液加入小室的上室（40 μL/室）。實驗重復3次，每組實驗設置3個復孔。

1.2.5 檢測糖酵解中葡萄糖消耗與乳酸水平 采用乳酸脫氫酶比色法檢測細胞培養液中的乳酸水平，采用葡萄糖檢測試劑盒說明書檢測葡萄糖消耗，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。實驗重復3次，每組實驗設置3個復孔。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達 提取各組A549細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白變性，SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，封閉2 h，分別加入一抗稀釋液（1︰1 000）與二抗稀釋液（1︰5 000），室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。實驗重復3次，每組實驗設置3個復孔。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 柴胡皂苷D對A549細胞增殖能力的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組細胞活力均顯著降低（P<0.05），克隆形成數均顯著減少（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 柴胡皂苷D對A549細胞遷移、侵襲能力的影響及相關蛋白表達量 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組遷移及侵襲細胞數均顯著減少（P<0.05），E-cadherin蛋白水平顯著升高（P<0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1、2和表2。

2.3 柴胡皂苷D對A549細胞糖酵解水平的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組葡萄糖消耗、乳酸水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 柴胡皂苷D對A549細胞中VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白表達量的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組的VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表4。

2.5 轉染pcDNA-VEGF可逆轉柴胡皂苷D對A549細胞增殖、遷移、侵襲及糖酵解水平的抑制作用 與SSD-H+pcDNA組比較，SSD-H+pcDNA-VEGF組細胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平均顯著升高（P<0.05），克隆形成數、遷移及侵襲細胞數均顯著增多（P<0.05）。見表5。

2.6 各組VEGF、VEGFR2、p-MEK、E-cadherin、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量 與SSD-H+pcDNA組比較，SSD-H+pcDNA-VEGF組E-cadherin蛋白水平顯著降低（P<0.05），VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著升高（P<0.05），見表6、圖4。

3 討論

非小細胞肺癌治療方式多樣化，但化療等方式具有一定毒副作用，因而尋找安全有效的治療方式對改善患者預后具有重要意義，既往研究顯示，中草藥可有效抑制肺癌細胞遷移及侵襲，同時相關報道指出VEGF/VEGFR2信號通路在肺癌發生及發展過程中發揮重要調控作用，并可能作為肺癌治療靶點[8-10]。

柴胡皂苷D是從柴胡根莖中分離出的三萜皂苷，并可抑制乳腺癌、胃癌等腫瘤細胞增殖及分裂，促進細胞凋亡，還可逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性[11-12]。柴胡皂苷D可抑制肺癌移植瘤生長，但關于其作用機制尚未闡明[13]。柴胡皂苷D可抑制mTORC信號轉導通路的活化從而促進肝癌細胞自噬及凋亡[14]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，不同濃度的柴胡皂苷D處理后可明顯降低細胞增殖能力，并可減少遷移及侵襲細胞數，且呈劑量依賴性，提示柴胡皂苷D可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。有研究表明上，皮-間質轉化與腫瘤細胞轉移密切相關，其中E-cadherin屬于上皮細胞標志物，N-cadherin、Vimentin屬于間充質細胞標志物，E-cadherin表達下調可促進N-cadherin、Vimentin表達從而促進上皮-間質轉化最終促進細胞轉移[15]。本研究結果顯示，柴胡皂苷D處理后E-cadherin蛋白水平升高，而N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低，且呈劑量依賴性，提示柴胡皂苷D可能通過調控上皮-間質轉化從而抑制非小細胞肺癌細胞遷移及侵襲。腫瘤細胞發生糖酵解時葡萄糖消耗后產生乳酸，此過程產生的ATP較少導致糖酵解活性升高，進而促進腫瘤細胞增殖及遷移[16-17]。本研究結果顯示柴胡皂苷D可明顯降低非小細胞肺癌細胞中葡萄糖消耗、乳酸水平，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示柴胡皂苷D可能通過降低糖酵解水平從而抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

血管生成與內皮細胞增殖、遷移等密切相關，抑制血管生成是抑制腫瘤進展的重要途徑，VEGF/VEGFR2信號通路可調節內皮細胞增殖、遷移及侵襲，VEGF可結合VEGFR2而促進VEGFR2磷酸化，激活下游信號級聯反應，主要包括MEK/ERK信號通路等，MEK、ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其在細胞增殖、分化等生物學過程中發揮重要調控作用，并可作為VEGF/VEGFR2信號通路的下游基因進而參與血管生成過程[18-20]。本研究結果顯示不同劑量的柴胡皂苷D處理后VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平降低，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示柴胡皂苷D可能通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路從而發揮抗非小細胞肺癌作用。同時本研究將pcDNA-VEGF與柴胡皂苷D聯合處理非小細胞肺癌細胞，結果顯示細胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平升高，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數增多，VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin表達上調，而E-cadherin表達下調，提示VEGF過表達可明顯降低柴胡皂苷D對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，柴胡皂苷D可通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路的活化從而抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲，可為進一步闡釋柴胡皂苷D抗腫瘤作用機制奠定實驗基礎，但關于其具體作用機制仍需進一步探究。

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（收稿日期：2021-01-22） （本文編輯：姬思雨）