基于非靶向代謝組學評價傳統發酵對客家酸芥菜酚類化合物組成的影響

唐富豪，滕建文，韋保耀，黃麗，夏寧，覃超

(廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧，530004)

酚類物質是植物中普遍存在的次生代謝產物，包括多酚、黃酮、酚酸等，絕大多數具有鎮痛、抗自由基和抗腫瘤等多種生物學活性和藥理作用[1]。芥菜屬于十字花科、蕓薹屬，目前國內外研究表明芥菜及其發酵制品含有多種多酚物質[2]。NICCIO等[3]在南美芥菜中檢出了7種酚類物質，包括4種酚酸(4-羥基苯甲酸、對香豆酸、阿魏酸和芥子酸)和3種黃酮類物質(柚皮苷、芹菜素、山奈酚)；HARBAUM等[4]對新鮮芥菜中的酚酸進行含量鑒定，發現芥子酸含量最高，沒食子酸含量最少；LI等[5]對瘤莖芥菜進行靶向代謝組學分析，結果表明酚類物質含有黃酮醇、羥基肉桂酰衍生物、黃烷酮和黃酮。盡管如此，已報道的芥菜酚類物質占比仍不足其總酚含量的30%[6]，芥菜的酚類組成仍未探明，這影響著芥菜的物質分析和功能評價。

發酵蔬菜是世界傳統食品，根據加工過程中是否留鹵分為留鹵腌漬和倒置腌漬，后者除浙江倒篤菜外[7]，兩廣客家酸芥菜(地方俗稱“客家擦菜”)是其中的典型代表?，F有研究已證實，發酵過程對蔬菜中酚類物質組成產生了顯著影響，進而影響其營養吸收率及生物活性。經過適當的發酵，芥菜中的酚類物質含量有所提高，如咖啡酸的含量在發酵過程中顯著增加[8]。盡管目前從蔬菜總酚、總黃酮等含量上已明確發酵的作用，但由于芥菜酚類物質具有多樣性，發酵過程如何引起各酚類物質變化，進而影響其生理活性，仍少有報道。

本項研究針對新鮮芥菜和客家擦菜，利用非靶向代謝組學方法，應用超高效液相色譜串聯質譜技術，檢測酚類物質組成，并分析其差異性變化，揭示其多酚、酚酸及黃酮物質組成，為蔬菜發酵過程中化學物質表征和功能成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

新鮮芥菜采集于廣西陸川古城鎮。客家擦菜取自廣西陸川泓源食品有限公司，其基本加工工藝為：新鮮芥菜清洗后曬制脫水，切段(1～2 cm)后裝入瓦罐中壓實并倒置發酵(7～10 d)；將菜取出并加2%(質量分數)食鹽拌勻，裝回瓦罐中壓實，倒置進行二段發酵1個月以上。取新鮮芥菜和發酵成品各12個樣品，分別混勻后取3個平行，收集密封后低溫下運回實驗室，于-80 ℃保存。

1.2 樣品制備及測定

1.2.1 樣品提取

樣本于液氮中研磨，取100 mg加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩后，冰浴靜置5 min。于15 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取一定量的上清液加質譜級水稀釋至甲醇體積分數為53%，并于4 ℃，15 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于LC-MS分析。質控樣本由2組不同的樣本提取物等量混合制備而成，空白樣本為含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液。該部分委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.2 LC-MS/MS分析

利用超高效液相色譜和串聯質譜進行物質鑒定[9-10]。液相分析條件：(1)色譜柱：Thermo Hyperil Gold column C18(2.1 nm×100 nm，1.9 μm)；(2)流動相：正離子模式水相為超純水(0.1%甲酸)，有機相為甲醇；負離子模式水相為超純水(5 mmol/L 醋酸銨、pH 9.0)，有機相為甲醇；(3)洗脫梯度：0～1.5 min為V(水)∶V(甲醇)=98∶2，12.0～14.0 min為0∶100，14.1～17.0 min為98∶2；(4)流速為0.2 mL/min；柱溫40 ℃。質譜條件為：質譜電壓3 200 V，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，離子傳輸管溫度320 ℃，二級掃描為數據依賴性掃描。該部分委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 定性定量分析

將色譜數據文件導入Compound Discoverer 3.1搜庫軟件中，用空白樣本去除背景離子，依據保留時間、質荷比等參數進行簡單篩選。根據保留時間偏差0.2 min和質量偏差5×10-6進行峰對齊。設置信號強度偏差30%、信噪比3、最小信號強度100 000、加和離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量，再整合目標離子，通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與mzCloud、mzVault、MassList數據庫和諾禾致源公司的自建數據庫進行比對。

1.3 數據處理

采用多元統計分析，對2組樣本進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚類分析和相關性分析，根據偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)預測模型的穩定可靠性。設置閾值為：變量影響投影(variable influence on projection，VIP)>1.0，差異倍數(fold change，FC)>1.5或 FC < 0.667 且P<0.05篩選差異酚類物質。對差異酚類物質進行聚類分析，并上傳至KEGG網站，進行代謝通路分析。采用Excel對下機數據進行初步分析后，利用Origin 2019軟件繪制PCA圖，SPSS 23進行顯著性分析，云平臺繪制熱圖及高級氣泡圖。

2 結果與分析

2.1 芥菜及客家擦菜中酚類物質的非靶代謝組學分析

針對新鮮芥菜和客家擦菜，結合總離子流色譜圖，2種材料在正、負離子模式下均分別檢出84、53種酚類物質，共136種(芥子酸在2種模式下均有檢出)。其中，119種物質在芥菜及其發酵產品中首次檢出，另外8種酚酸和9種黃酮類物質在芥菜研究中已有報道。具體信息見表1。

KHANAM等[11]用HPLC-二極管陣列檢測器測定日本芥菜中的酚類物質，主要為芥子酸、金絲桃苷、水楊酸、對香豆酸和香蘭素酸。高媛等[12]在多個品種的新鮮蔬菜及制品中發現阿魏酸、異阿魏酸和對香豆酸3種酚酸的含量最高。已有研究表明，芥菜中的主要黃酮類物質為黃酮醇、羥基肉桂酰衍生物、黃烷酮和黃酮。本實驗結果基本包括前人對于芥菜等綠葉蕓薹屬作物及其發酵制品的靶向研究結果[4,11]。本實驗結果包含已報道的酚類物質類別，并檢測出更多的多酚物質，且首次在芥菜及發酵芥菜中定性檢出大豆苷元及雌馬酚等。

表1 新鮮芥菜與客家擦菜中鑒定出的酚類物質統計 單位：種

2.2 新鮮芥菜和客家擦菜中酚類物質差異性分析

2.2.1 PCA結果

圖1為新鮮芥菜和客家擦菜2組樣品的PCA圖。其中PC1的貢獻率為68.5%，PC2的貢獻率為26.3%，兩者累計貢獻率達到94.8%。2個主成分反映的主要指標有芥子酸、山奈酚、對羥基肉桂酸、阿魏酸、異阿魏酸、2-羥基肉桂酸和水楊酸等，表明酚酸物質是新鮮芥菜和客家擦菜的主體特征組分，也是與發酵處理相關性系數最高的成分。與PARK等[13]對發酵芥菜中酚類物質組成變化的結論一致。2種樣品分別在PC1、PC2表現出組內聚集趨勢，且在PC1中表現出組間分離趨勢，整體上表明新鮮芥菜經發酵后，酚類物質的組成發生顯著改變。

A-新鮮芥菜；B-客家擦菜圖1 酚類物質的PCA結果Fig.1 PCA results of phenolic compounds

2.2.2 酚類物質差異性鑒定

PCA可以有效提取主要信息，但對于相關性較小的變量不敏感。而PLS-DA可使組間區分最大化，利于準確篩選差異代謝物。如表2所示，綜合VIP值、FC值和P值判定發酵前后差異性酚類物質。結果表明，有29種酚類物質的含量經發酵后發生顯著變化，占2種材料中所有酚類物質的21.48%，包括14種酚酸物質、8種黃酮類物質、3種異黃酮物質、2種黃酮醇物質，1種查爾酮和1種花青素。發酵后，含量差異倍數最大的為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷(FC為1 543)，其次為水楊酸和對羥基肉桂酸等。

PARK等[14]評估了芥菜中酚類物質在不同發酵時期的變化，發現咖啡酸的含量在發酵前期波動，2個月后顯著下降，綠原酸的含量持續降低，且成品中含量相比原料為顯著下降。此外，LE等[15]報道了乳桿菌屬產生的酯酶可將生咖啡中綠原酸轉化為咖啡酸；發酵小麥的阿魏酸含量顯著高于未發酵小麥[16]；使用植物乳桿菌發酵平菇使阿魏酸的含量顯著增加[17]。本實驗結果發現非糖苷鍵鍵合類黃酮如芹菜素、槲皮素、柚皮素、山奈酚、橙皮素、楊梅素、川陳皮素等物質的含量在發酵后升高；糖苷鍵鍵合類黃酮例如山奈酚-3-O-雙糖苷、芹苷-7-葡萄糖苷、蘆丁、三葉豆苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷等物質的含量在發酵后降低。參考現有關于芥菜及發酵芥菜研究，顯著變化的酚類物質種類基本一致，但考慮到客家擦菜在發酵過程中始終有物質隨水分流出，因此未表現出顯著變化的物質需進一步絕對定量確認。

表2 客家擦菜和新鮮芥菜中顯著性差異的酚類物質Table 2 Significantly different phenolic compounds between fresh Brassica juncea and Hakka sour mustard

2.3 差異酚類物質富集通路分析

通過KEGG數據庫對所有顯著差異的酚類物質進行通路富集分析，得到7條代謝通路(圖2)，分別為(1)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成通路，包括原兒茶酸等；(2)次生代謝產物的合成通路，包括槲皮素、原兒茶酸、水楊酸、異甘草素等；(3)植物激素信號轉導通路，包括反式玉米素、水楊酸；(4)酪氨酸代謝通路，包括2,5-二羥基苯甲酸；(5)代謝途徑，包括2,5-二羥基苯甲酸、槲皮素、原兒茶酸等；(6)黃酮和黃酮醇的合成通路，包括丁香亭、蘆丁、槲皮素、三葉豆苷、山奈酚、楊梅素等；(7)芪類、二苯基庚酮和姜酚生物合成，包括姜黃素。且由圖2可知次級代謝產物合成途徑通路的富集程度最高，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成通路的富集最為顯著。

現有研究表明，植物多酚的前體物質來源于糖代謝的中間產物，經莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑合成。其中沒食子酸是由莽草酸途徑中間產物3-羥基莽草酸在相關酶作用下合成，其余大多數酚酸類物質都是通過苯丙烷代謝途徑合成。而莽草酸代謝途徑生成的4-羥基查爾酮則是類黃酮代謝途徑的前體物質[18]。苯丙烷代謝途徑是植物中合成木質素及類黃酮物質的重要次生代謝途徑之一，而莽草酸途徑在植物次生代謝途徑中起到了中心作用，為其他次生代謝途徑提供底物。本研究中未富集到莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑，可能是核心物質莽草酸作為非酚酸物質未被鑒定分析，苯丙氨酸及對香豆酸的含量未發生顯著性變化。由于尚無對新鮮芥菜及發酵蔬菜中酚類物質的代謝通路富集，故本次富集到的7條通路可為發酵對酚類物質的影響提供參考。

圖2 新鮮芥菜與客家擦菜中顯著性差異酚類物質的 KEGG富集圖Fig.2 KEGG enrichment map found in significantly different phenolic compounds between fresh Brassica juncea and Hakka sour mustard注：點的顏色代表P值，越紅表示富集越顯著；點的大小代表 富集到的差異代謝物的數量

3 討論

3.1 針對本實驗未檢到和非顯著差異酚酸物質的討論

本研究在新鮮芥菜和客家擦菜中檢測到的42種酚酸多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物。MOCO等[19]研究發現盡管不同品種蔬菜的多酚物質有所不同，但這些代謝產物的整體分類相同。綠原酸作為咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，在植物有氧呼吸過程中可由肉桂酰酯酶經莽草酸途徑轉化肉桂酸和奎寧酸形成?？Х人岬纳锖铣芍饕ňG原酸的水解和對香豆酸的轉化。已有研究發現芥菜的發酵降低了綠原酸的含量，但造成咖啡酸含量的增加，將這些變化歸因于發酵的乳酸菌產酯酶活性[13]。而在本研究中，部分羥基肉桂酸類酚酸，咖啡酸、沒食子酸、異綠原酸及阿魏酸未發生顯著變化。此前，在橄欖發酵過程中，已證實酚類物質損失主要是由于向鹽水中的擴散[20]。經過比對甲醇和水2種提取溶劑的提取結果，發現甲醇的提取效果更佳，但不乏個別酚類物質僅在水相中被檢測到的現象[14]。并且有一些水溶性酚類物質在發酵過程中隨水分持續流出，因此尚無法準確判斷部分水溶性酚類物質的顯著性變化是否僅為代謝活動導致[13]。

現有關于芥菜及其發酵制品的研究均未檢測到莽草酸，但檢測到有莽草酸代謝途徑產物沒食子酸。莽草酸作為莽草酸代謝途徑的重要底物，與苯丙烷代謝途徑聯系密切?？紤]芥菜品種、留鹵與倒置無鹵發酵工藝及加入食鹽濃度的差異和樣品處理方法的不同，可能導致類似研究中酚酸物質表現出不同的含量變化。

3.2 針對槲皮素與其糖苷物質含量變化的討論

天然槲皮素多以糖基結合成糖苷的形式存在，相關研究表明，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率，槲皮素在體內的生物利用率及抗氧化活性優于槲皮素糖苷[21]，且糖苷在攝取后幾乎不被吸收。前人在蕓薹屬作物菜心[15]、西藍花[6]及刺梨[21]中均有檢測出槲皮素，而對芥菜利用標品靶向測定槲皮素的一些研究中，仍存在未檢測到的情況[3,8]。本研究在2種材料中均檢出槲皮素，并發現其含量經發酵后呈顯著上升，其糖苷物質槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量呈顯著性下降，可知發酵影響了槲皮素糖苷物質的水解轉化。目前實驗室多用β-葡萄糖苷酶、α-鼠李糖苷酶及α-L-鼠李糖苷酶等水解黃酮糖苷配基，而微生物則是這些酶的主要來源[22]。有研究報道乳桿菌屬具有β-葡萄糖苷酶活性，可轉化大豆異黃酮糖苷，表現出高效的槲皮素釋放能力[23]。雖已篩選出一些具有產酶能力的乳酸菌，但不同菌種發酵轉化糖苷配基的水平存在差異，且作用機制尚未徹底清晰，亟待跟進研究。

目前，二氫槲皮素的生物合成過程已經基本探明，涉及到苯丙烷和類黃酮2個階段[24]。本研究發現，發酵后二氫槲皮素和柚皮素的含量均未呈顯著性變化，并且未檢到圣草酚、二氫山奈酚等。因此，在差異代謝物富集KEGG通路時，未能富集到苯丙烷和類黃酮2個途徑。

3.3 乳酸菌發酵影響酚類物質

現有研究表明，參與發酵的多種乳酸菌都具有使膳食多酚脫羧、脫脂、脫甲基和脫糖基化的能力[25-27]。適當的發酵可能是改善蔬菜發酵制品的化學特性，并增強其潛在生物活性的有效途徑[28]。研究報道了一些細菌和酵母可將羥基肉桂酸(例如咖啡酸、阿魏酸)脫羧為乙烯基酚[29]。腸道微生物和其他乳酸菌被證明能夠通過肉桂酰酯酶將綠原酸轉化為咖啡酸和奎寧酸[27]。約翰遜乳桿菌NCC 533產生的酯酶和羥肉桂酸脫羧酶，可分2步將5-咖啡?？崴嵬耆鉃榭Х人醄28]。通過乳酸菌合成的β-葡萄糖苷酶等，可以去糖基定向修飾黃酮類物質的分子結構，發揮其特定功能[30]。此外乳酸菌具有將果蔬中游離酯、結合態酚酸分解為游離態酚酸的作用，并使其生物活性增強。乳酸菌在發酵過程中產生的水解酶可通過分解細胞壁而釋放出結合的酚類物質，從而增加酚類物質的含量[31]。并且，乳酸菌可以保護某些多酚在生理條件下免受化學降解[32-33]。發酵蔬菜中存在大量的乳酸菌，并篩選出一些具有代謝多酚物質能力的菌株，但具體轉化機制尚未完全清晰，可以深入探究，以期通過發酵將多酚物質轉化為具有更高生物利用度和生物活性的物質。

4 結論

當前研究已對部分芥菜品種和發酵芥菜中具體酚類物質進行定性定量分析，但尚不清晰2種材料的酚類物質組成。本實驗采用非靶向代謝組學，首次較系統報道了新鮮芥菜和客家擦菜中酚類物質組成。通過顯著變化的酚類物質及相關代謝通路，為探索發酵對酚類物質的影響及代謝機制提供參考。現有研究更多集中于蔬菜發酵前后酚酸的變化，針對黃酮類物質的研究鮮有報道。盡管一些酚類物質在發酵后未表現出顯著變化，已明確具有生物活性的酚類物質仍待進一步定量確認。對植物多酚物質代謝途徑的研究已取得較大進展，但其生物合成代謝較為復雜，因此可分離發酵乳酸菌對其相關酶學特性進行代謝調控研究。