一株紅樹(shù)林來(lái)源稀有放線菌的鑒定和抑菌活性物質(zhì)的初步研究

張駿梁，張?jiān)娏幔瑓羌鸦郏S姍姍，梁錦有，徐穎*

1(深圳大學(xué) 生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市海洋藻類生物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室， 廣東 深圳，518060)2(深圳大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳，518060) 3(中國(guó)藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京，211198)

細(xì)菌耐藥性的威脅日益嚴(yán)重，尋找新型抗菌藥物已迫在眉睫[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物一直是微生物藥物的重要來(lái)源[2]。但隨著抗生素開(kāi)發(fā)的“黃金時(shí)代”遠(yuǎn)去，從陸生或土壤微生物中難以尋找到新的抗菌活性物質(zhì)[3]。于是人們轉(zhuǎn)向研究海洋[4-5]、荒漠[6]或極端環(huán)境微生物[7]，它們長(zhǎng)期生長(zhǎng)于特殊環(huán)境下，形成了較為獨(dú)特的生理代謝途徑，具有產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物的潛力。

我們從香港米埔濕地紅樹(shù)林植物的根際沉積物中，分離到1株放線菌XY-R10，初步鑒定為擬孢囊菌屬[8]的Kibdelosporangiumphytohabitans(K.phytohabitans)，為1株稀有放線菌。該菌公開(kāi)的基因組大小為11.76 Mb[9]，使用antiSMASH 5.0對(duì)基因組注釋分析[10]，預(yù)測(cè)有49個(gè)生物合成基因簇，說(shuō)明其具有產(chǎn)生多種活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛能。目前已從擬孢囊菌屬的多株菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的化合物，如Aridicins[11]、Kibdelins[12]、Azicemicins[13]和Kibdelomycins[14]等，而對(duì)K.phytohabitans次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們對(duì)菌株XY-R10發(fā)酵粗提物的抑菌譜和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)合液相-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem high-resolution mass spectrometry,LC-HRMS)分析粗提物中的成分，以期為該菌具有抑菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的挖掘和開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

紅樹(shù)林植物秋茄[Kandeliacandel(L.) Druce]，中國(guó)香港，米埔內(nèi)后海灣拉姆薩爾國(guó)際重要濕地(E 114.05°，22.49°)；以無(wú)菌操作法，取根際3～5 cm深的沉積物，裝入無(wú)菌密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室在24 h內(nèi)完成處理。

1.1.2 抗菌活性測(cè)試用菌株

金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)ATCC 25923、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)ATCC 43300、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC 29212、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)ATCC 35667、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 6051、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)ATCC 12228、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)ATCC 13813、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19115、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAO1、大腸桿菌(Escherichiacoli)O157:H7、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)CMCC 50335、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)ATCC 17802，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

TSB、MH、BHI肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，肉湯中添加1.8%～2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂為固體培養(yǎng)基；R2A、ISP-2培養(yǎng)基，美國(guó)BD DifcoTM公司。

斜面孢子培養(yǎng)基：ISP-2培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，玉米淀粉10，黃豆餅粉10，硫酸銨2，玉米漿干粉5，去離子水1 L，pH(7.2±0.1)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，甘油20，Peptone 20，人工海鹽20，碳酸鈣5(調(diào)整pH后加入)，去離子水1 L，pH (7.5±0.1)。

1.1.4 主要試劑

Peptone、Yeast Extract，英國(guó)OXIOD公司；人工海鹽，廣州益爾生物工程有限公司；Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒(B518255)、SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒(B518131)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Collismycin A、Maipomycin B和Collismycin X，深圳金普邁生物科技有限公司；C18硅膠填料(50 μm，120 ?)，蘇州納微科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)，日本島津公司；Agilent 1260/6545 Q-TOF液質(zhì)(LC-MS)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；Waters 2695-2996制備液相色譜儀，沃特世科技有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道爾夫公司；LRH-70恒溫培養(yǎng)箱、THZ-100恒溫?fù)u床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；1300生物安全柜，賽默飛世爾科技有限公司；SMZ-168體視顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 放線菌的分離

將沉積物樣品浸泡在無(wú)菌海水中配制成混懸液，用梯度稀釋法將混懸液稀釋后，吸取10-2～10-6梯度的稀釋液100 μL均勻涂布于R2A培養(yǎng)基固體平板上，平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～8 d。對(duì)平板上長(zhǎng)出的菌落進(jìn)一步劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)物，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，編號(hào)并保藏。

1.3.2 菌株16S rRNA序列的測(cè)定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

DNA抽提試劑盒提取菌株XY-R10的基因組DNA，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-T-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：模板DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP 4 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳到EzBioCloud網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)[15]，下載相似性最高的前10株菌的16S rDNA序列。用MEGA 7.0對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)，Phylogeny中選擇鄰接法構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 菌株形態(tài)觀察

將菌株XY-R10在ISP-2培養(yǎng)基平板上劃線，另取滅菌蓋玻片斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，平板在28 ℃培養(yǎng)7～8 d后，觀察記錄菌落形態(tài)，并取出長(zhǎng)有菌絲的蓋玻片，用結(jié)晶紫染色，油鏡(1 000×)下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.4 放線菌發(fā)酵和產(chǎn)物粗提取

將XY-R10接種于斜面孢子培養(yǎng)基(ISP-2培養(yǎng)基)，28 ℃培養(yǎng)7～8 d后接種到種子培養(yǎng)基搖瓶中，在28 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)42～48 h。種子液按5%接種量接種至發(fā)酵搖瓶，在28 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)6 d。將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心10 min 取上清液，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相減壓濃縮得發(fā)酵粗提物，二甲基亞砜溶解備用。

1.3.5 抑菌活性檢測(cè)方法

(1)紙片法測(cè)定抑菌活性：參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M02-A11進(jìn)行。

(2)微量稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：參照CLSI的藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M07-A9和M45-A，用96微孔板測(cè)定。

1.3.6 抑菌活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性考察[16]

取發(fā)酵粗提物溶解于水中，分別用0.1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至3、5、7、9、11，未調(diào)節(jié)pH值的粗提物水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，未調(diào)節(jié)pH值的水、pH 3和pH 11的水為陰性對(duì)照，MRSA為活性指示菌，紙片法檢測(cè)調(diào)完pH值后粗提物的抑菌活性，考察不同pH處理對(duì)粗提物抑菌活性的影響。另取調(diào)節(jié)為不同pH值的粗提物溶液，在60 ℃ 水浴處理3 h后檢測(cè)抑菌活性，考察不同pH處理下粗提物抑菌活性的溫度穩(wěn)定性。

1.3.7 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱ACE Excel 5 C18-HL，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：V(10 mmol/L甲酸銨)∶V(乙腈)=9∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)200～600 nm；流量1 mL/min；柱溫35 ℃。梯度洗脫：0～20 min，A(0～40%)；20～35 min，A(40%～80%)；35～40 min，A(80%)；40.01～45 min，A(0)。

質(zhì)譜條件：Dual AJS ESI，Auto MS(2) Mode；Gas Temp：325 ℃；Drying gas：10 L/min；Nebulizer：40 psi；Sheath Gas Temp：350 ℃；Sheath Gas Flow：12 L/min；VCap：4 000 V；Nozzle Voltage：500 V。

1.3.8 抑菌活性物質(zhì)初步分離

取發(fā)酵粗提物上樣于C18硅膠柱(徑高比6∶1)，依次用10%～100%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液洗脫，分部分收集洗脫液。各部分洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥為干粉，檢測(cè)各分離段的MIC值。

將40%甲醇洗脫的部分用制備液相色譜儀制備Maipomycin A，色譜條件：Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(250 mm×21.2 mm, 5 μm)，V(乙腈)∶V(水)=25∶75，流量為4 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XY-R10的形態(tài)特征

菌株XY-R10在ISP-2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好(圖1-a)，菌落呈圓形凸起，無(wú)光澤，表面干燥、有褶皺，貼緊培養(yǎng)基生長(zhǎng)，不易挑起。氣生菌絲豐富，為白色或灰白色，體視鏡下能觀察到致密、絨狀的菌絲，具有一般放線菌的特征(圖1-b)。菌落周圍產(chǎn)生黑褐色可溶性色素，擴(kuò)散在瓊脂中。將其氣生菌絲用結(jié)晶紫染色后在放大1 000倍的油鏡下觀察(圖1-c)，能看到細(xì)長(zhǎng)、不規(guī)則彎曲的菌絲，菌絲形成長(zhǎng)、直或彎曲的圓柱形孢子鏈，另外在菌絲中有許多球形、籠狀的結(jié)構(gòu)。

a-菌株XY-R10在ISP-2平板的生長(zhǎng)形態(tài)；b-體視鏡觀察菌株XY-R10 的菌落形態(tài)；c-油鏡觀察菌株XY-R10的氣生菌絲形態(tài)(1 000倍)圖1 菌株XY-R10的形態(tài)特征分析Fig.1 Analysis of morphological characteristics of the strain XY-R10

2.2 菌株XY-R10的系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株XY-R10進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，序列信息上傳至EzBioCloud網(wǎng)站比對(duì)，下載相似性較高的序列，用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示(圖2)，菌株XY-R10隸屬擬孢囊菌屬，與KibdelosporangiumphytohabitansKLBMP 1111T同源，相似度達(dá)99.79%。結(jié)合該菌的形態(tài)特征與文獻(xiàn)報(bào)道相比較，放線菌XY-R10為很可能與KibdelosporangiumphytohabitansKLBMP 1111T為同1個(gè)種，是1株稀有放線菌。

圖2 基于菌株XY-R10的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of the strain XY-R10

2.3 發(fā)酵粗提物抑菌活性的研究

菌株XY-R10發(fā)酵第6天的上清液對(duì)MRSA有較好的抑菌活性，如圖3-a所示，載樣量為10 μL上清液紙片的抑菌圈直徑(約17 mm)，略高于載藥量10 μg萬(wàn)古霉素紙片的抑菌圈直徑(約15 mm)。考察了不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的抑菌活性，抑菌活性物質(zhì)僅在發(fā)酵第6～8天出現(xiàn)(圖3-b)。

將發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取制備粗提物，以多株臨床及食源性致病菌為指示菌，測(cè)定粗提物的抗菌譜。結(jié)果如表1所示，粗提物對(duì)MSSA、MRSA、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的MIC≤8 μg/mL，表現(xiàn)出較好的抑菌活性；對(duì)糞腸球菌和單增李斯特菌的MIC分別為128、256 μg/mL，抑菌活性微弱。粗提物對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的MIC>512 μg/mL，無(wú)抑菌活性；對(duì)副溶血弧菌有微弱的抑菌作用(MIC=256 μg/mL)。因此，該粗提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較廣譜的抑菌活性。

2.4 粗提物中抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

對(duì)粗提物抑菌活性成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果見(jiàn)表2。室溫條件下，粗提物水溶液pH值調(diào)節(jié)為3、5、7時(shí)，抑菌圈大小與對(duì)照(未調(diào)節(jié)pH，原始pH值為6.6左右)基本一致，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)在中性和弱酸性條件下較穩(wěn)定。當(dāng)pH值提高至9和11時(shí)，抑菌圈變小，說(shuō)明堿處理使抑菌活性物質(zhì)不穩(wěn)定因而活性降低。

a-發(fā)酵7 d的上清液對(duì)MRSA的抑菌活性；b-發(fā)酵上清液抑菌 活性隨發(fā)酵時(shí)間的變化圖3 發(fā)酵液上清抑菌活性的發(fā)現(xiàn)Fig.3 Antibacterial activity of fermentation broth注：萬(wàn)古霉素10 μg，苯唑西林10 μg，發(fā)酵上清液10 μL

表1 發(fā)酵粗提物MIC的測(cè)定 單位：μg/mL

研究了酸堿和加熱同時(shí)處理對(duì)抑菌活性物質(zhì)的影響。粗提物水溶液在pH值為3時(shí)，經(jīng)60 ℃熱處理后抑菌圈略微減小，活性略微降低；而pH越高，熱處理后粗提物抑菌活性越差甚至失去活性。因此，粗提物中的抑菌活性物質(zhì)在弱酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較好，不耐受堿性環(huán)境，熱穩(wěn)定性較差。

表2 pH和溫度對(duì)抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of pH and temperature on the stability of antibacterial active substances

2.5 粗提物分段分離后各部分的抑菌活性

使用C18柱對(duì)粗提物進(jìn)行分段分離，并檢測(cè)各分離段的抑菌活性，結(jié)果如表3所示。用20%～60%甲醇洗脫的各分離段對(duì)MRSA具有不同程度抑菌活性，但它們的MIC值均高于粗提物、抑菌活性減弱，在MSSA、糞腸球菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、無(wú)乳鏈球菌中也有類似的結(jié)果。使用HPLC分析，各分離段的峰各不相同。推測(cè)粗提物中可能存在多個(gè)活性成分，粗提物廣譜抗革蘭氏陽(yáng)性菌的作用可能為多個(gè)成分聯(lián)合的效果，因此經(jīng)分離后，各分離段的單獨(dú)作用的抑菌活性減弱。70%～100%甲醇洗脫的各分離段對(duì)所有菌株無(wú)抑菌活性(MIC>512 μg/mL)；各分離段對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌均無(wú)抑菌活性(MIC>512 μg/mL)。

值得注意的是，與粗提物相比，40%甲醇洗脫的分離段對(duì)單增李斯特菌和副溶血弧菌的MIC值降低，抑菌活性有所增強(qiáng)，我們首先對(duì)這一分離段的成分進(jìn)行研究。

表3 粗提物經(jīng)初步分離后各分離段MIC的測(cè)定 單位：μg/mL

2.6 LC-HRMS分析發(fā)酵粗提物成分

由圖4分析可知，粗提物中有超過(guò)9個(gè)較為明顯的組分，其中峰5～峰9來(lái)源于培養(yǎng)基。峰1和峰2的一級(jí)質(zhì)譜[M+H]+m/z分別為308.075 9和308.071 0，經(jīng)Mass Hunter定性分析軟件計(jì)算分子式均為C13H13N3O4S，二者有一些相同的二級(jí)質(zhì)譜碎片m/z290.05、m/z210.06、m/z181.06等，但紫外吸收峰略有不同，推測(cè)二者可能為同分異構(gòu)體。峰1為Maipomycin A，是本實(shí)驗(yàn)室之前從菌株XY-R10篩選到的具有強(qiáng)效殺藻活性的化合物(圖4-h，原命名為Kibdelomycin A，后發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道化合物重名，現(xiàn)改為Maipomycin A)[17-18]。結(jié)合HPLC-DAD檢測(cè)粗提物用40%甲醇分離的部分，該部分的主要成分是Maipomycin A，因此下一步對(duì)Maipomycin A的抑菌活性進(jìn)行研究。

峰3在正離子模式下無(wú)質(zhì)譜響應(yīng)，負(fù)離子模式的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z為394.163 4，經(jīng)計(jì)算分子式為C23H25NO5。峰3紫外吸收峰在240、268、299、336 nm，與Azicemicin A(圖4-i，分子式C23H25NO9)有類似的紫外吸收(234、277、322、335 nm)[13]。Azicemicin A分離自擬孢囊菌屬的另一株菌Kibdelosporangiumsp.MJ126-NF4[19]，具有抗金黃色葡萄球菌活性(MIC ≥ 100 μg/mL)[13]，而峰3的分子式比Azicemicin A少4個(gè)氧原子，推測(cè)峰3可能為Azicemicins類化合物。

a-發(fā)酵粗提物HPLC圖；b-峰1紫外吸收?qǐng)D；c-峰1一級(jí)質(zhì)譜圖；d-峰2紫外吸收?qǐng)D；e-峰2一級(jí)質(zhì)譜圖；f-峰3紫外吸收?qǐng)D； g-峰3一級(jí)質(zhì)譜圖；h-Maipomycin A結(jié)構(gòu)；i-Azicemicin A結(jié)構(gòu)圖4 LC-HRMS分析發(fā)酵粗提物成分Fig.4 LC-HRMS analysis the fermentation extracts

2.7 Maipomycin A抑菌活性的研究

Maipomycin A具有2,2′-聯(lián)吡啶的結(jié)構(gòu)，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌無(wú)抑菌活性，僅對(duì)表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，MIC分別為32、16、32 μg/mL(表4)。含有2,2′-聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物還有Caerulomycins[20]、Collismycins[21]和Pyrisulfoxins[22]等，這類化合物具有抗菌、細(xì)胞毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用[23]，我們比較了Maipomycin A的3個(gè)結(jié)構(gòu)類似物(圖5)的抑菌活性。如表4所示，Collismycin A同樣對(duì)表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，活性與Maipomycin A相當(dāng)，但Maipomycin B和Collismycin X的抑菌活性就相對(duì)較弱。從結(jié)構(gòu)上看，Maipomycin A和Maipomycin B僅在6位的基團(tuán)有差異(圖5)，前者是醛肟基，而后者是醛基，Collismycin A和Collismycin X結(jié)構(gòu)上的差異也是如此。因此推測(cè)Maipomycin A和Collismycin A的抑菌活性很可能與6位的醛肟基有關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論基本一致[25]。

表4 Maipomycin A及其類似物MIC的測(cè)定 單位：μg/mL

a-Collismycin A結(jié)構(gòu)；b-Maipomycin B結(jié)構(gòu)；c-Collismycin X結(jié)構(gòu)圖5 Maipomycin A類似物結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structures of Maipomycin A analogues

3 結(jié)論

紅樹(shù)林潮間帶是一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，孕育著豐富而新穎的微生物資源，是研究微生物天然產(chǎn)物的熱點(diǎn)之一[24]。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事海洋和紅樹(shù)林來(lái)源微生物的分離及活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，菌株XY-R10即為紅樹(shù)林植物根際沉積物中分離得到的其中1株放線菌，本文對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定和抑菌活性的研究。經(jīng)菌落特征識(shí)別、顯微鏡觀察，測(cè)序比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析，初步鑒定為擬孢囊菌屬的K.phytohabitans，是1株稀有放線菌。

放線菌XY-R10的發(fā)酵粗提物對(duì)多種常見(jiàn)的臨床和食源性致病菌有較好抑菌作用，具有廣譜的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性。抑菌活性物質(zhì)在弱酸性條件下較穩(wěn)定，耐熱性差。粗提物經(jīng)分段分離后，各分離段的抑菌活性均減弱，推測(cè)粗提物中可能含有多個(gè)活性成分，其廣譜抗革蘭氏陽(yáng)性菌的的作用可能為多個(gè)成分聯(lián)合的效果。利用LC-HRMS鑒定出粗提物中一個(gè)成分為Maipomycin A，此外還可能存在Maipomycin A和Azicemicin A的類似物。Maipomycin A對(duì)表皮葡萄球菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌有抑菌作用，其抑菌作用可能與6位的醛肟基相關(guān)，可為后續(xù)作用機(jī)制探索、構(gòu)效關(guān)系研究提供參考。

綜上，本文對(duì)紅樹(shù)林來(lái)源稀有放線菌XY-R10進(jìn)行了分離和鑒定，并對(duì)其具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了挖掘和初步研究，有望為臨床抗菌藥物的研發(fā)，以及食品工業(yè)進(jìn)行抑菌防腐、生物防治提供一定的理論參考和實(shí)踐依據(jù)。