青稞膳食纖維和多酚對腸道微生物的協同調節作用

魯朝鳳,黃佳琦,黃勇樺,楊士花,陳壁,楊明靜,李永強*

1(云南農業大學 食品科學技術學院, 云南 昆明, 650201)2 (杭州漢庫醫學檢驗所有限公司, 浙江 杭州, 310000) 3(滇西應用技術大學 普洱茶學院, 云南 普洱, 665099)4 (云南農業大學 外語學院, 云南 昆明, 650201)

腸道微生物群是一個復雜的微生物生態系統，大約有1014個細菌組成，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和放線菌門[1-3]。腸道微生物群能夠參與體內難消化碳水化合物等成分的代謝[4-5]，同時能夠與宿主腸道系統相互作用，保障黏液層結構的完整，阻止病原菌在宿主腸道內的定植[6]。腸道微生物群失衡可以引發炎癥性腸病、癌癥、肥胖和代謝綜合征等慢性疾病[2]。因此，維持腸道微生物群的平衡與人體健康密切相關。然而，單純攝入含有乳酸菌、雙歧桿菌和乳球菌等益生菌制劑，一方面在體內停留時間較短，僅為14 d，沒有發揮益生作用；另一方面腸道黏膜菌群對益生菌產生定植抵抗，引起腸道微生物群的失衡[7-8]。所以，合理膳食能夠調節腸道微生物組成，維持腸道微生物群平衡[9]。

膳食纖維在小腸中難以消化和吸收，可以到達結腸，并與微生物群相互作用，能夠促進有益菌生長，抑制有害菌繁殖，調節腸道微生物組成[10]，具有預防肥胖、降低代謝綜合征風險的作用[11-12]。多酚化合物的生物有效性和生物利用度較低，90%～95%在小腸中不能被消化和吸收，到達結腸后能夠與腸道微生物相互作用，調節腸道微生物群，維持腸道微生物群落平衡[9]。研究表明，多酚化合物能夠促進乳桿菌等有益菌生長，抑制致病菌生長[3]，降低厚壁菌門(Phylum Firmicutes)和擬桿菌門(Phylum Bacteroidetes)的比例，修復腸道微生物失調，緩解高膽固醇血癥[2,12]，預防肥胖等慢性疾病[11]。

膳食纖維和多酚均能改變腸道微生物群的組成和結構，保持腸道微生物菌群的動態平衡，促進人體健康。青稞(HordeumvulgareL.var.nudumhook.f.)作為云南省迪慶藏族自治州高原特色谷物[10]，含有豐富的多酚和膳食纖維[13]。目前關于膳食纖維和多酚協同調節腸道微生物的研究鮮有報道，因此本研究提取青稞中不可溶膳食纖維-多酚(insoluble dietary fiber-phenolic compounds，IDF-PC)和可溶性膳食纖維-多酚(soluble dietary fiber-phenolic compounds，SDF-PC)，利用體外結腸發酵，通過16S rRNA高通量測序，研究膳食纖維和多酚對腸道微生物的協同調節作用，以期為青稞促進機體健康和預防疾病提供科學依據，為青稞深加工提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云黑青稞由云南省迪慶藏族自治州農科所提供。2-(N-嗎啉)乙磺酸-水合物(MES monohydrate)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，北京索萊寶科技有限公司；阿魏酸標準品、耐高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶、糖化酶、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海晶純生化科技股份有限公司；福林-酚試劑、豬α-淀粉酶、豬胃蛋白酶、豬膽汁鹽、豬胰液素、豬黏液素，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；厭氧產氣袋和去氧劑，三菱瓦斯化學株式會社；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

M-304不銹鋼五谷雜糧磨粉機，廣州雷邁機械設備有限公司；TGL20M離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；UV-1800CP紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，金壇市城西麗華實驗儀器廠；ZD-85A雙功能數顯恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；L6J-12冷凍干燥機，鄭州南北儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膳食纖維-多酚復合物的制備

參考LEE[14]和李永強等[15]的方法。準確稱取100 g青稞面粉(hulless barley powder，HBF)，取1 500 mL MES-Tris緩沖液溶解，加入耐高溫α-淀粉酶，酶解后，用NaOH調節pH值至10.5，加入堿性蛋白酶，反應后用HCl調節pH值至4.25，加入糖化酶酶解。酶解結束后，離心，棕色沉淀為IDF-PC，收集合并后凍干，于-80 ℃避光保存。離心后上清液加入乙醇溶液，靜置過夜，離心后所得白色沉淀為SDF-PC，收集合并后凍干，于-80 ℃避光保存。

1.3.2 多酚化合物及膳食纖維含量測定

1.3.2.1 可溶性和不可溶鍵合多酚的提取

按LI等[16-18]的方法提取多酚化合物。分別稱取HBF、IDF-PC、SDF-PC各2 g，加入70%(體積分數)丙酮溶液，室溫超聲提取，離心后得上清液，重復3次。合并上清液，30 ℃真空旋轉蒸發至干，用甲醇溶解得可溶性多酚化合物。離心殘渣加入NaOH，室溫水解4 h，用鹽酸調節pH值為2，離心，上清液用乙醚和乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，真空旋轉蒸發至干，用甲醇溶解得不可溶鍵合多酚化合物，于4 ℃下避光保存備用。

1.3.2.2 多酚含量測定

采用福林-酚試劑比色法[16-18]測定樣品中可溶性和不可溶鍵合多酚含量。以阿魏酸制定標準曲線，為y=1.289x-0.003 (R2=0.998)，所得結果用阿魏酸當量(ferulic acid equivalents，FAE)表示，結果表示為μmol FAE/g 干樣(dry sample,DS)。樣品總多酚含量為可溶性和不可溶鍵合多酚含量之和。

1.3.2.3 膳食纖維含量測定

據1.3.1中的方法制備膳食纖維多酚復合物，得到膳食纖維-多酚(dietary fibber-phenolic compounds，DC-PC)，并計算HBF中膳食纖維含量。IDF-PC、SDF-PC中膳食纖維含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1，樣品質量,g；m2，多酚質量,g。

1.3.3 體外結腸發酵

根據ANOMA等[17-19]方法制備胃腸殘渣。分別稱取一定量HBF，SDF-PC，IDF-PC，加入蒸餾水和NaCl溶液，于37 ℃水浴，定期振搖使樣品溫度達37 ℃。加入豬α-淀粉酶水浴消化后，利用HCl調節pH值至2，然后加入豬胃蛋白酶，暗處消化2 h，得到模擬胃消化產物懸濁液。用NaOH調節pH值至6.5，依次加入膽汁鹽，豬胰液素，豬黏液素進行消化。然后樣品離心得到上清液和殘渣，殘渣加入蒸餾水后再次離心，合并上清液，殘渣凍干用于結腸發酵。

將糞便樣品用磷酸緩沖溶液稀釋并過濾，以過濾的渾濁液作為接種物。配制培養基，于121 ℃滅菌15 min，加入凍干的胃腸殘渣和腸道微生物渾濁液，分別培養5、10、24、48 h。設置HBF、IDF-PC和SDF-PC 樣品組，阿魏酸(ferulic acid，FA)對照組和空白組(blank，B)。HBF組為糞便+HBF+培養基；IDF-PC組為糞便+培養基+IDF-PC；SDF-PC組為糞便+培養基+SDF-PC；FA組為糞便+培養基+FA；B組為豬糞便。發酵結束后，離心后得到的殘渣用于分析微生物多樣性。

1.3.4 短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)分析

根據PARKAR等[20]的方法提取SCFAs并測定含量，結腸發酵樣品離心后取上清液，加入NaCl、偏磷酸、CuSO4，渦旋混勻后，用乙醚提取，然后離心，將有機相轉移到試管中。加入NaOH溶液，振搖提取10 min，離心后，水相移到玻璃瓶中，加入磷酸溶液混勻，用于液相分析。

用島津高效液相色譜儀SPD-20A，島津色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在40 ℃下進行分離，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min，波長為214 nm，流動相：A為甲醇，C為磷酸氫二銨溶液(1.5 g加入600 mL超純水溶解，用1 mol/L磷酸溶液調節pH值至2.78)，條件為：0 min，A∶C(0∶100)；7 min，A∶C(5∶95)；15 min，A∶C(40∶60)；24 min，A∶C(40∶60)；25 min，A∶C(0∶100)；35 min，A∶C(停止)。

1.3.5 微生物16S rRNA測序

16S rRNA測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。DNA的提取根據OMEGA-soil DNA Kit試劑盒說明書的方法進行提取。利用NanoDrop2000檢測DNA純度，利用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。擴增樣品中的16S rRNA基因V3～V4可變區，引物為：338F和806R。PCR(ABI GeneAmp?9700型)采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，Forward Primer(5 μmol/L)和Reverse Primer(5 μmol/L)各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，ddH2O 11.79 μL。

PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個循環；72 ℃后延伸10 min。采用2%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠回收PCR產物，用Tris-HCl洗脫。將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。進行Miseq文庫構建，在Miseq PE300平臺進行高通量測序。

1.3.6 腸道微生物生物信息學分析

Miseq測序得到的是雙端序列數據，首先根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接成1條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。使用Trimmomatic軟件進行去雜，過濾read尾部質量值20以下的堿基。在97%的序列相似度水平上，使用Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse)軟件對所有序列進行可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析。參考數據庫為Silva (Release123 http://www.arb-silva.de)[21]，利用RDP classifier貝葉斯算法[22]對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，通過對比Silva[23]數據庫(Release119 http://www.arb-silva.de)；在門水平和屬水平統計各樣本的群落組成。細菌群落組成采用直觀的柱狀圖呈現，樣品中分類水平未被命名的種類命名為“others”。用mothur軟件計算樣品的α多樣性指數。

根據β多樣性距離矩陣進行層次聚類分析，使用非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)算法構建樹狀結構。通過主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)樣本微生物群落組成差異性或相似性。

1.3.7 數據處理與分析

實驗所得到的數據均以平均值±標準偏差表示。數據使用SPSS 22.0中的單因素方差進行分析，表中所有實驗數據均以均值±標準差表示。數據顯著性利用Tukey test(P<0.05)檢驗。

2 結果與分析

2.1 總多酚及膳食纖維含量

HBF、IDF-PC、SDF-PC中多酚和膳食纖維含量見表1，3種樣品中總多酚含量和膳食纖維含量差異顯著(P<0.05)。HBF與IDF-PC和SDF-PC相比，HBF總多酚含量最高，為26.90 μmol FAE/g DS，其次是IDF-PC、SDF-PC，分別為24.45、7.54 μmol FAE/g DS；3種樣品中，SDF-PC膳食纖維含量最高，其次為HBF和IDF-PC，分別為99.85%、99.53%、30.76%。

表1 三種樣品中總多酚含量和膳食纖維含量Table 1 The total phenolic and dietary fiber content of three samples

2.2 16S rRNA分析微生物的組成

2.2.1 腸道微生物多樣性分析

使用the Good′s coverage指數來分析樣品的測序覆蓋率，HBF、IDF-PC、SDF-PC樣品組，空白組B和對照組FA的測序覆蓋深度均大于99.56%，說明測序數據量合理。

α多樣性分析主要通過豐度指數(Ace指數、Chao1指數)和多樣性指數(Shannon指數、Simpson指數)來進行表征，結果見表2，4種樣品經結腸發酵后，在前24 h，Ace和Chao1指數呈顯著降低趨勢(P<0.05)，說明微生物的豐度均呈下降趨勢，可能由于前24 h多酚對腸道微生物的抑制起主要作用，導致微生物數量下降；24 h后，Ace和Chao1指數變化不明顯，說明微生物豐度差異不大，可能由于多酚和膳食纖維的協同調節作用，導致微生物生長趨于平衡。Shannon指數和Simpson指數呈先下降后上升趨勢，可能由于發酵前期多酚對微生物的抑制起主導作用，導致微生物多樣性指數降低，發酵后期膳食纖維促進了微生物的生長，導致微生物多樣性指數升高。HBF、IDF-PC和SDF-PC發酵48 h后，Ace指數、Chao1指數和Shannon指數高于FA對照組，但Simpson指數變化無明顯差異，說明膳食纖維多酚對腸道微生物的調節作用優于單一多酚。

HUANG等[24]通過體外實驗，發現兒茶素、槲皮素和葛根素能夠降低腸道微生物多樣性，與本研究結果一致。WANG等[11]利用SDF喂養肥胖小鼠，增加了小鼠腸道微生物的α-多樣性，本研究結果與其相反，可能是因為多酚和膳食纖維協同調節作用。

表2 不同樣品的豐度和多樣性Table 2 Abundance and diversity of different samples

β多樣性主要利用PCoA進行研究，結果如圖1所示，在5、10 h時，HBF和IDF-PC組相距較近，說明HBF和IDF-PC組的微生物組成較為相似。在24 h時，HBF和SDF-PC組樣本混合在一起，說明此時HBF和SDF-PC組的微生物組成相似度較高，而IDF-PC和FA組則相互分開，與其他樣本相似度較低。在48 h時，HBF、IDF-PC和FA組彼此之間分離，而SDF-PC間則較為分散，說明此時各組的微生物組成相似度較低。結腸發酵5 h時，不同樣品之間清晰分離，說明此時樣品對腸道微生物的調節作用最好。結合圖3屬水平微生物組成分析可知，3種樣品對有益菌的調節作用優于FA，進一步說明了膳食纖維和多酚的協同調節作用優于單一多酚。

2.2.2 微生物群落結構分析

門水平微生物群落結構分析如圖2所示，HBF、IDF-PC和SDF-PC樣品組、B組和FA對照組中主要的優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等。LIU等[25]利用動物實驗和體外結腸發酵實驗研究多酚及膳食纖維對腸道微生物的調節作用，發現厚壁菌門和擬桿菌門為優勢菌門，與本研究結果相似。

圖1 基于OTU豐度的PCoA主坐標分析Fig.1 PCoA based on OTU abundance注：F-5、F-10、F-24、F-48、H-5、H-10、H-24、H-48，I-5、I-10、I-24、I-48，S-5、S-10、S-24、S-48分別表示FA，HBF，IDF-PC和SDF-PC發酵5、10、24、48 h

研究表明，厚壁菌門/擬桿菌門比例與體重呈正相關[13,26]。由圖2可知，HBF、IDF-PC、SDF-PC樣品組和FA對照組經結腸發酵后，腸道微生物菌門厚壁菌門/擬桿菌門的比例在5 h時分別為53.53%、82.39%、96.48%和116.11%；10 h時分別為35.57%、38.74%、33.86%和125.38%；24 h時分別為2.95%、6.26%、4.76%和0.75%；48 h時分別為1.04%、1.74%、3.93%和0.45%，說明隨著發酵時間的增加均能夠降低腸道微生物菌門厚壁菌門/擬桿菌門的比例。JIN等[27]發現利用葡萄籽提取物灌喂小鼠能夠降低腸道微生物中厚壁菌門/擬桿菌門的比例，與本研究結果一致，說明膳食纖維和多酚能夠降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，有助于預防肥胖，維持人體健康。

圖2 門水平微生物組成Fig.2 Composition of microbial community at phylum level

屬水平微生物群落結構分析見圖3和圖4。由圖3可知，空白組、樣品組與對照組對微生物群落結構均具有一定的調節作用。與空白組相比，樣品組與對照組在5、10、24、48 h均抑制了部分微生物的生長，包括考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、擬桿菌目S24-7(Bacteroidales-S24-7-group-norank)、顫螺菌屬(Oscillospira)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae-unclassified)、理研菌屬RC9(Rikenellaceae-RC9-gut-group)、顫桿菌屬(Oscillibacter)、密螺旋體屬2(Treponema-2)、擬桿菌目RF16(Bacteroidales-RF16-group-norank)、普雷沃氏菌科NK3B31(Prevotellaceae-NK3B31-group)和普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae-UCG-003)。對照組在4個時間點對擬桿菌目S24-7、顫螺菌屬、理研菌屬RC9的抑制作用大于3種樣品。研究發現，酚類化合物對有害腸道細菌有一定的抑制作用，對有益腸道細菌有一定促進作用[28]。本研究結果可能與酚類化合物的抑菌作用有關。HBF、SDF-PC和IDF-PC之間對微生物的抑制作用無明顯差異，可能是3種樣品中均含有膳食纖維和多酚，對微生物具有相似的調節作用[2,9]。

與空白組相比，樣品組與對照組也促進了部分微生物的生長。在48 h內，樣品組與對照組均促進了乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃菌科UCG-005(Ruminococcaceae-UCG-005)、瘤胃菌科NK4A214 (Ruminococcaceae-NK4A214-group)、艾克曼菌屬(Akkermansia)的生長。乳桿菌作為一種益生菌，能夠改善腸道微生物平衡，緩解結腸易激綜合征[29]。艾克曼菌屬(Akkermansia)與高脂飲食誘發的代謝疾病呈負相關[1,29]。瘤胃菌科UCG-005和瘤胃菌科NK4A214能夠降解膳食纖維產生短鏈脂肪酸，調整人體的脂質代謝[29]。與對照組相比，樣品組能夠明顯促進乳桿菌屬、瘤胃菌科UCG-005、瘤胃菌科NK4A214-和艾克曼菌屬的生長，說明膳食纖維和多酚能夠促進部分有益微生物的生長，且對微生物的協同調節作用優于單一多酚。研究發現，膳食纖維和多酚可以促進乳桿菌屬、艾克曼菌屬、瘤胃菌科UCG-005和瘤胃菌科NK4A214的生長[2,20]，與本研究結果一致。在3種樣品之間，HBF和IDF-PC對主要優勢微生物具有相似的調節作用，SDF-PC對微生物的調節作用與HBF、IDF-PC差別較大，可能是3種樣品中膳食纖維和多酚的含量與結構存在差異，導致了不同的微生物調節作用。

圖3 屬水平的微生物組成Fig.3 Composotion of microbial community at genus level

圖4為豐度前30的OTUs進行分層聚類制作的熱圖，圖中色塊顏色代表某一個屬相對豐度的大小，每一行代表一種屬水平的微生物名稱，每一列代表一種樣品，能夠直觀的反應每組之間屬水平的微生物豐度變化。由圖4可知，與空白組相比，對照組和樣品組有不同的微生物圖譜，均能夠改變微生物群落組成，對腸道微生物具有一定的調節作用。

圖4 微生物群落在屬水平上的相對豐度Fig.4 The relative abundance of the microorganism community at the taxa level of genus in groups注：圖中僅列出30個屬

2.3 短鏈脂肪酸分析

SCFAs不僅能夠為厭氧菌提供能量，促進其生長，還可以降低腸道環境的pH值，抑制有害菌的生長，調節腸道微生物平衡，從而改善腸道紊亂[30]。同時SCFAs也可以為腸上皮細胞提供營養物質，促進腸黏膜生長，維持腸黏膜屏障的完整性，進一步改善腸道功能，促進機體健康[30]。未被上消化道吸收的膳食纖維及多酚，可以在結腸中被腸道微生物群發酵，得到SCFAs，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等[31]，其中乙酸、丙酸、丁酸占SCFAs總量的95%以上，且乙酸是腸道中含量最多的SCFAs[32]。SCFAs的主要產生菌是厚壁菌門、擬桿菌門，為人類腸道中含量最豐富的2個門類[26,33]。厚壁菌門主要產生丁酸，擬桿菌門主要產生乙酸和丙酸[26]。研究表明，葡萄及葡萄酒多酚的攝入可以調節微生物產生SCFAs，促進乙酸、丙酸、丁酸含量增加[32]。

HBF、IDF-PC和SDF-PC經腸道微生物代謝后，產生的3種SCFAs見表3，在3種樣品中乙酸是主要短鏈脂肪酸，顯著高于丙酸和丁酸(P<0.05)，含量分別為(0.29±0.21)、(0.15±0.05)和(0.14±0.10)mg/mL。HBF中乙酸和丁酸含量顯著高于IDF-PC和SDF-PC(P<0.05)，分別為(0.29±0.21)和(0.11±0.27)mg/mL，且HBF中的SCFAs含量高于SDF-PC和IDF-PC(P<0.05)，為(0.44±0.2) mg/mL。本研究發現，經腸道微生物發酵后，HBF產生的總SCFAs含量最高，其次是IDF-PC和SDF-PC，與3種樣品中多酚含量變化趨勢相同(表1)，可能是由于HBF中含有較高的多酚，能夠調節腸道微生物，從而生成較多的SCFAs[16]。

表3 短鏈脂肪酸含量 單位：mg/mL

3 結論

本研究通過高通量測序方法研究了膳食纖維-多酚復合物在體外結腸發酵過程中對腸道微生物的協同調節作用。研究發現，HBF、IDF-PC和SDF-PC中均含有較豐富的膳食纖維和多酚。樣品組與對照組相比，均能夠增加腸道微生物的豐度和多樣性，促進有益菌的生長。同時，能夠降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，具有一定預防肥胖的作用。3種樣品在腸道微生物的作用下，能夠產生較多的SCFAs，其中乙酸含量最高，說明膳食纖維和多酚對腸道微生物具有較好的協同調節作用。本研究為青稞促進機體健康和預防疾病提供科學依據，也為青稞功能食品的開發提供了新思路。