秋香梨果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

顏飛翔 朱 丹 牛廣財 魏文毅 王思溥

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

秋香梨是黑龍江省農(nóng)科院園藝所培育而成的秋子梨(PyrusussuriensisMaxim.)品種，果實圓形，肉質細膩多汁，可溶性固形物含量高，酸甜適口，是加工梨汁的優(yōu)良品種[1]。梨功效在中國歷代本草學中均有記載[2]。近年來，因梨中含有多酚、類黃酮、綠原酸等生理活性物質，其具有較好的抗氧化活性[3]。現(xiàn)代醫(yī)學研究[4]也證實了梨的清熱鎮(zhèn)靜和降低血壓的作用。目前梨規(guī)模化生產(chǎn)的加工產(chǎn)品主要以果汁、梨膏、罐頭類為主，而其他梨酒、梨醋等產(chǎn)品較少。

果醋一般是以水果為原料，經(jīng)酶解處理、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成的一種營養(yǎng)豐富的酸性調味品，富含維生素、氨基酸和碳水化合物，能夠補充人體所需的營養(yǎng)物質[5]。果醋可以改善肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥等[6]。目前，中國已有學者對庫爾勒香梨[7]、雪花梨[8]、皇冠梨[9]等梨醋的發(fā)酵工藝進行了研究，但有關秋香梨果醋的發(fā)酵工藝及抗氧化能力評價尚未見報道。

研究擬采用液態(tài)發(fā)酵方法，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優(yōu)化滬釀1.01醋酸菌發(fā)酵秋香梨果醋的工藝條件，并通過1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力和Fe3+還原能力來評價秋香梨果醋的抗氧化能力，為秋香梨果醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

秋香梨酒：酸質量濃度為1.5 g/L，酒精度為12%vol(20 ℃)，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院；

菌種：滬釀1.01醋酸桿菌，黑龍江省八一農(nóng)墾大學食品學院發(fā)酵實驗室保存；

DPPH：純度>97%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

ABTS：純度>99%，美國Sigma公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫震蕩培養(yǎng)箱：HZXQ-R型，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；

震蕩培養(yǎng)箱：HZQ-F160型，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；

全溫震蕩培養(yǎng)箱：HZQD-D型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；

電子分析天平：BN2484型，上海民橋精密儀器有限公司；

立式壓力滅菌鍋：LDZX-40Ⅱ型，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺：BCN-1360型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

pH計：SG2型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

過濾機：EYCKW-1型，溫州市東頂機械制造有限公司；

冰箱：BCD-235YH型，青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秋香梨果醋加工工藝

醋酸菌

↓

秋香梨酒→酒度調整→接種→醋酸發(fā)酵→陳釀→澄清過濾→殺菌→成品

操作要點：

(1) 酒度調整：參照董玉新[10]的方法，修改如下：取500 mL酒精度為12%vol的秋香梨原酒，根據(jù)前期預試驗，用純凈水將酒精度調整為7%vol(20 ℃)。

(2) 醋酸菌活化：向500 mL三角瓶中加入葡萄糖1 g，酵母膏1 g，蒸餾水100 mL，真空度0.1 MPa下滅菌30 min，接入醋酸菌，30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，得活化好的醋酸菌，菌數(shù)達5×106CFU/mL，備用。

(3) 接種：取500 mL梨酒于1 000 mL三角瓶中，在超凈工作臺上接入不同接種量的醋酸菌液。

(4) 醋酸發(fā)酵：將接種后的三角瓶放入恒溫震蕩箱中，轉速為130 r/min，在試驗設計的接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和初始pH等條件下進行發(fā)酵。

(5) 陳釀：秋香梨果醋發(fā)酵液于室溫陳釀30 d。

(6) 澄清過濾：陳釀結束后除去大部分菌株代謝物和部分沉淀后，添加質量分數(shù)為0.5%的殼聚糖，處理1 h，過濾。

(7) 殺菌：采用巴氏殺菌，75 ℃殺菌20 min。

1.2.2 單因素試驗

(1) 接種量對秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間7 d，考察接種量(4%，6%，8%，10%，12%)對總酸含量的影響。

(2) 發(fā)酵時間對秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵溫度31 ℃，接種量10%，考察發(fā)酵時間(1，2，3，4，5，6，7 d)對總酸含量的影響。

(3) 發(fā)酵溫度對秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發(fā)酵時間7 d，接種量10%，考察發(fā)酵溫度(25，28，31，34，37 ℃)對總酸含量的影響。

(4) 初始pH對秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響：固定酒精度7%vol，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間7 d，接種量10%，考察初始pH(3.2，3.8，4.4，5.0，5.6)對總酸含量的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，固定初始酒精度為7%vol，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應值，采用Box-Behnken中心組合原理設計四因素三水平響應面試驗，優(yōu)化秋香梨果醋醋酸發(fā)酵工藝。

1.2.4 指標測定

(1) 酒精度：蒸餾法。

(2) 總酸含量：常規(guī)酸堿滴定法(以醋酸計)。

(3) DPPH自由基清除率：根據(jù)樊秋元等[11]的方法。

(4) ABST自由基清除率：根據(jù)杜朝東等[12]的方法。

(5) Fe3+還原力：根據(jù)樊秋元等[13]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗重復3次，采用Origin 8.5軟件繪圖，響應面試驗通過Design-Expert 8.0.6進行試驗設計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1(a)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨接種量的增加先升高后降低，當接種量為10%時，總酸含量最高達53.31 g/L；當接種量>10%時，由于營養(yǎng)物質多消耗在菌體細胞的生長繁殖上，同時會出現(xiàn)菌體過早老化，生成的醋酸量減少，影響發(fā)酵效果[14]。因此，選擇秋香梨果醋發(fā)酵的醋酸菌最佳接種量為10%。由圖1(b)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發(fā)酵時間的延長先升高后略降低，發(fā)酵第6天，發(fā)酵液的總酸含量達到峰值，繼續(xù)發(fā)酵則發(fā)酵液中的總酸含量呈下降趨勢。這可能是隨著發(fā)酵時間的延長，營養(yǎng)物質被逐漸消耗，當發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(尤其是酒精)缺乏時，醋酸菌會分解醋酸，出現(xiàn)過氧化現(xiàn)象，酸度降低[15]。因此，選擇6 d為最佳發(fā)酵時間。

圖1 各因素對秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

由圖1(c)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高先上升后下降，當發(fā)酵溫度<31 ℃時，醋酸菌的代謝活動減弱，總酸含量較低；隨著發(fā)酵溫度的升高，31 ℃時秋香梨果醋的總酸質量濃度最高值達51.98 g/L；當溫度>31 ℃時，高溫會抑制醋酸菌中相關酶的活性，產(chǎn)酸量降低[16]；因此，31 ℃為最佳發(fā)酵溫度。由圖1(d)可知，隨著pH值的增加，總酸含量先升高后急速下降。當初始pH為4.4時，發(fā)酵液中總酸質量濃度達最高52.11 g/L。當初始pH>4.4時，醋酸菌細胞的生理功能受影響，秋香梨果醋的酸度急劇降低，同時影響產(chǎn)品品質[17]。因此，最佳初始pH選擇4.4。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面因素水平設計 根據(jù)單因素試驗結果，以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應值，進行四因素三水平的響應面試驗設計，因素及水平編碼見表1，試驗設計與結果見表2。

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對表2中數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)回歸擬合后得到二次回歸方程：

表1 因素與水平編碼表

Y=52.76-2.96X1+0.39X2-0.41X3+0.78X4-

(1)

2.2.3 響應面分析 響應曲面的陡度及等高線與坐標軸交點個數(shù)能在一定程度上反映試驗因子對響應值影響的大小。若曲面坡度平緩，則因素值的變化對響應值影響較小；反之，則影響較大。等高線與坐標軸交點個數(shù)越多，則對響應值影響越大；反之，則較小。等高線的形狀越扁平也說明交互作用越強。對秋香梨果醋中總酸含量影響顯著的交互項有X1X2和X1X4。其響應面圖和等高線圖如圖2所示。由圖2可知，響應面圖非常陡峭，等高線圖也呈現(xiàn)較扁平的橢圓形，并且X1對總酸含量的影響大于X2和X4，與方差分析結果一致。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.4 實驗驗證 利用已建立的數(shù)學模型預測秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為醋酸菌接種量9.45%，發(fā)酵時間5.90 d，發(fā)酵溫度31.15 ℃，初始pH 4.49。考慮實際操作，修正工藝條件為醋酸菌接種量9.4%，發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下的總酸含量為54.45 g/L，與理論預測值53.25 g/L誤差較小，說明該模型能較好地預測秋香梨果醋的醋酸發(fā)酵工藝。

表3 回歸模型的方差分析?

2.3 秋香梨果醋的抗氧化能力

由表4可知，發(fā)酵后秋香梨果醋的抗氧化能力顯著提高(P<0.05)，ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力分別較發(fā)酵前提高了23.65%，21.17%，30.23%，與廖良坤等[18-19]的結果一致。Merve等[20]研究發(fā)現(xiàn)，酸櫻桃醋的抗氧化能力與其功能性化合物如沒食子酸和綠原酸有關；陳怡等[21]研究表明，釀造醋的總多酚、總黃酮含量與總抗氧化能力以及超氧自由基、DPPH自由基和羥基自由基清除率均極顯著相關(P<0.01)；孫璐宏等[22]研究表明，柿果醋的總抗氧化能力與總酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)。因此，發(fā)酵后秋香梨果醋的抗氧化性能顯著提高，可能與果醋發(fā)酵過程中醋酸含量大幅上升有關。同時，隨著發(fā)酵時間的延長，梨醋中的醇類和醛類化合物會氧化成酸類化合物，如乙酸和己酸[23-24]。此外，還與發(fā)酵帶來的一些微生物其他發(fā)酵產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，如轉化黃酮和生物堿類物質，以及發(fā)酵過程中多種有機酸的相互作用有關。

3 結論

秋香梨果醋醋酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為醋酸菌接種量9.4%，發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下秋香梨果醋總酸含量為54.45 g/L。秋香梨酒經(jīng)醋酸菌發(fā)酵后，表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化能力，其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力分別提高了21.17%，23.65%，30.23%。后續(xù)將對該果醋發(fā)酵過程中品質及發(fā)酵前后風味成分變化進行分析。

圖2 各因素對總酸質量濃度的交互作用

表4 秋香梨果醋的抗氧化能力?