高效液相色譜法測定植物油中游離棉酚的不確定度評定

龍錦林 王春麗 陶銀鳳 孫曉晗 李 爍

(1. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102；2. 山東城控檢測技術有限公司，山東 濟南 250102)

游離棉酚是一種多酚羥基萘醛類化合物，主要存在于未精煉或精煉不徹底的棉籽油中，由于存在具有活性的醛基和羥基而具有較強的毒性[1]。中國國家標準規定：食用植物油中游離棉酚的最大限量為200 mg/kg[2]。因此在各級食品安全監督檢驗中，游離棉酚是植物油產品中一個重要的監控指標。不確定度是表征合理地賦予測量值的分散性[3]，以便使用人員能夠評價測量值的可靠程度[4]，因此游離棉酚檢測的不確定度是一個涉及評價中國植物油質量安全的重要參數。目前有關游離棉酚含量的檢測研究較多[5-7]，但未對其檢查結果的不確定度進行評定。

同時，食品檢驗檢測機構應根據需要建立和保持應用測量不確定度的程序[8]，并在測量不確定度影響符合性判定等情況時，檢驗報告中給出測量結果的不確定度[9]。文章擬通過GB 5009.148—2014《食品安全國家標準 植物性食品中游離棉酚的測定》測定植物油中游離棉酚，并依據不確定度評估的相關標準與規范[10-11]，建立一種植物油中游離棉酚檢測結果不確定度的數學模型，對游離棉酚檢測過程中產生不確定度的主要來源進行分析與評定，旨在為評估植物油中游離棉酚檢測結果的質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

食用植物油：市售；

棉酚標準品：≥95%，中國藥品生物制品檢定所；

磷酸、無水乙醇、丙酮：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

高效液相色譜儀：Waters e2695型，美國沃特世公司；

電子天平：BSA2245型，德國賽多利斯公司；

電子天平：CPA2250型，德國賽多利斯公司。

1.2 試驗方法

依據GB 5009.148—2014對植物油中游離棉酚進行檢測。稱取油樣1.00 g于15 mL離心試管中，加入5 mL無水乙醇，渦旋5 min，冷藏靜置分層(1 h以上)，取上清液于2 mL離心管，14 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，上機檢測。

2 數學模型

建立如式(1)所示的模型：

(1)

式中：

X——試樣中棉酚含量，mg/kg；

m——試樣質量，g；

C——試樣測定液中棉酚含量，μg/mL；

V——萃取用無水乙醇體積，mL。

3 不確定度主要來源

從不確定度的傳播律來看，數學模型中各參數都可能有一個與檢測結果相關的不確定度，都是檢測結果不確定度的潛在來源[12]。從數學模型和測量過程可知，游離棉酚檢測結果不確定度主要來自：① 樣品稱量過程引入的不確定度urel(m)；② 萃取溶劑移取過程引入的不確定度urel(V)；③ 樣液中游離棉酚濃度引入的不確定度urel(C)，包括標準物質本身含量、標準物質配制過程使用的容器、校準曲線擬合、樣液中游離棉酚峰面積的重復性；④ 樣品均勻性及其前處理過程引入的不確定度urel(p)。

為了簡化不確定度評估程序，降低評估工作量，根據不確定度評估中“抓大放小”的原則，在評估過程中，對于貢獻率較小的因素，尤其是貢獻率小于最大影響因素1/10 的因素，則不加以計算評估[9]。由于檢測環境溫度對檢測結果的貢獻較小[13-14]，因此不討論室溫對檢測結果不確定度的影響。

4 結果與分析

4.1 樣品稱量引入的不確定度

混勻后直接使用電子天平稱取1.00 g油樣，電子天平最大質量允差為0.5 mg，按正態分布考慮，k=3。則由樣品稱量引入的標準不確定度為：

4.2 萃取體積引入的不確定度

4.3 樣液中游離棉酚濃度引入的不確定度urel(C)

樣液中游離棉酚濃度引入的不確定度主要來源于標準物質本身含量、標準物質配制、校準曲線擬合和樣液中游離棉酚峰面積的重復性4個方面。

4.3.2 標準物質配制引入的標準不確定度

(1) 稱量標準物質引入的標準不確定度：標準物質稱樣量為0.200 00 g，天平檢定最大質量允差為0.05 mg，其置信區間p=0.99，按正態分布考慮，k=3。

(2) 標準儲備溶液定容引入的不確定度：標準儲備液、中間標準液制備過程中使用了100 mL容量瓶、10 mL 容量瓶和500 μL移液器。

因此標準儲備溶液的定容和移取引入的相對不確定度：

故棉酚標準溶液配制引入的相對不確定度為：

4.3.3 校準曲線擬合校準引入的不確定度 按照試驗方法的要求，使用高效液相色譜儀對1，5，10，20，40 μg/mL標準溶液進行測定，每個水平重復測量3次，得到標準物質峰面積，各濃度的峰面積見表1。以濃度X為橫坐標，峰面積的平均值Y為縱坐標繪制標準曲線，建立線性回歸方程Y=7.96e+004X-18 827，R2=0.999。

表1 標準物質峰面積

按式(2)計算標準曲線擬合引入的不確定度。

(2)

式中：

S(A)——標準工作液峰面積殘差的標準偏差；

b——擬合標準曲線的斜率；

p——樣品的測量次數；

n——擬合標準曲線中標準點個數；

Ci——標準系列質量濃度，μg/mL；

Scc——溶液含量殘差的平方和。

植物油樣品測量重復6次，使用線性方程求得使用樣液中游離棉酚含量為9.64 μg/mL，則標準曲線擬合引入的相對不確定度：

4.3.4 樣液中棉酚峰面積引入的不確定度 試樣處理液峰面積測量的不確定度主要是高效液相色譜儀引入的不確定度；查高效液相色譜儀檢定證書得知，當k=2時，液相色譜儀引入的相對不確定度為urel(A)=0.04。

綜上，樣液中游離棉酚濃度引入的不確定度urel(C)為：

4.4 樣品處理過程中重復性引入的不確定度

檢測結果的重現性主要受樣品的均勻性和樣品前處理過程的一致性，以及檢測操作環境等因素影響，樣品前處理的重復性引入的不確定度可以用檢測結果的精密度來評估與表示[10]。基于標準方法驗證的需要，試驗所采用的濟南市市監督抽檢的植物油的游離棉酚含量低于標準檢測限(<2.5 mg/kg)，同時采用50 mg/kg作為添加質量濃度代替樣品的測試結果(見表2)。由表2可知，加標樣品測定結果的精密度為1.79%，平均回收率為96.36%。

表2 樣品測定結果的精密度和回收率

則樣品前處理的重復性引入的不確定度為：

4.5 合成標準不確定度

基于不確定度的傳播規律，游離棉酚檢測結果的不確定度可以通過各個分量的不確定度合成得到。由于游離棉酚檢測結果是各分量的乘積，且各分量是互不相關，因此按式(3)計算測量結果的不確定度[7]。

(3)

則

uc(x)=0.046 9×48.18=2.3。

4.6 擴展不確定度及其報告

擴展不確定度可由合成標準不確定度乘以包含因子，取置信區間p=95%，則k=1.96，約為2[10]，因此植物油中游離棉酚含量測定的擴展不確定度U(x)=2.3×2=4.6 mg/kg。

根據GB 5009.148—2014中檢出結果有效保留位數等要求，最終植物油中游離棉酚含量測定結果的報告為：

C=(48±5) mg/kg (K=2)。

5 結論

通過對植物油中游離棉酚含量的檢測，分析和評定了游離棉酚檢測過程中的不確定度主要來源，并計算出檢測結果的擴展不確定度。結果表明，植物油中游離棉酚含量檢測結果不確定度的重要來源為高效液相色譜儀的性能、樣品前處理的重復性以及標準曲線擬合。因此在植物油中游離棉酚檢測過程中，要做好高效液相色譜儀的性能維護與監控并加以控制；完善標準曲線的配置，做好標準物質的有效核查；加大檢測人員培訓，完善和規范檢測程序，確保人員操作的規范性和一致性。