雞蛋溶菌酶單克隆抗體的制備與鑒定

李 紅,劉成倩,嚴華祥,孫鳳萍,高 駿,姚惠娟,易建中

(上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海201106)

溶菌酶(Lysozyme)又稱為N-乙酰胞壁質聚糖水解酶、胞壁質酶,是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶[1],對革蘭氏陽性菌的抗菌能力最強,也能抑制革蘭氏陰性菌和真菌,還具有抗氧化能力。 溶菌酶作為一種生物體內的非特異性免疫因子,在抑殺病原體時不易產生抗藥性,具有無毒、無害、無殘留、抗菌譜廣、活性穩定、安全性高等優良抗菌特性[2]。 溶菌酶不僅在生物體內有非特異性免疫功能,哺乳動物還可以通過乳汁將這種功能傳遞給幼崽,提高幼崽的抗病力;家禽通過蛋清傳遞給種蛋,提高胚胎發育的抵抗力。 溶菌酶在食品工業(防腐劑)[3-4]、醫藥(酶類抗菌藥[5-6],抗病毒藥[7-8])、飼料(替代抗生素[9-12])和生物工程(生物酶[13])等領域已經得到廣泛運用,并有替代抗生素的趨勢。

雞蛋中的溶菌酶含量最高,占蛋清蛋白的3.5%,是提取溶菌酶的最佳來源[14-15]。 蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越強,越有利于雞蛋的儲藏,因此測定雞蛋蛋清中的溶菌酶對我國溶菌酶生產、禽蛋產品加工有重要的指導作用,其也是評定雞蛋品質的重要參數之一。 目前,蛋清中溶菌酶的定量測定還沒有一個較便捷的方法。 本研究通過制備溶菌酶抗體,旨在提供一種檢測雞蛋清中溶菌酶的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞系

SPF 級6—8 周齡雄性BALB∕c 小鼠購自復旦大學上海醫學院;SP2∕0 細胞為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50 ×HAT、50 ×HT、PEG4000 鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotype Reagent)和雞蛋溶菌酶標準品均購自美國Sigma-Aldrich 公司;DMEM 培養基購自美國Hyclone 公司;胎牛血清購自美國GIBCO 公司;Protein G Resin 購自金斯瑞生物科技有限公司;增強型HRP-DAB 底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;HRP 標記羊抗鼠IgG、FITC 標記的羊抗鼠IgG 均購自美國Jackson 公司;其他常規試劑均為國產。

1.3 SDS-PAGE 檢測溶菌酶

參照分子克隆實驗指南,進行SDS-PAGE[16],其中分離膠和積層膠濃度分別為8%和5%。

1.4 動物免疫及血清抗體效價檢測

選取3 只6—8 周齡健康BALB∕c 小鼠(編號為No.1—No.3),按每只小鼠100 μg 的劑量進行腹腔及背部皮下多點注射,免疫3 次。 首次免疫用弗氏完全佐劑,其余免疫用弗氏不完全佐劑。 免疫前和每次免疫后2 周尾靜脈采血,檢測抗體滴度。 融合前5 d 用相同劑量和方法對小鼠進行加強免疫。 溶菌酶蛋白以2 μg∕mL 的濃度包被酶標板,并用間接ELISA 方法檢測血清抗體水平。

1.5 細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆化

細胞融合及亞克隆參考文獻[17]。 無菌采集小鼠脾臟,將脾細胞按8∶1的比例與SP2∕0 細胞充分混合,用PEG4000(500 g∕L)進行融合。 按照脾細胞2 ×106個∕mL、100 μL∕孔計算,輕輕加入預溫的HT 培養液。 24 h 后,每孔補加含有2 倍量A 的HAT 培養液,每孔100 μL。 4 d、7 d 和14 d 時分別半量換HAT 培養液、HT 培養液和普通DMEM 培養液。 每天觀察細胞狀態,標記融合細胞,待克隆細胞生長至孔底1∕4面積以上時,利用間接ELISA 法對上清液進行抗體效價檢測,篩選陽性雜交瘤細胞,用有限稀釋法篩選單克隆,并擴大培養、凍存,直到所有的克隆細胞孔都為陽性。

1.6 腹水制備及純化

取18—22 周齡健壯的雌性BALB∕c 小鼠,每只小鼠腹腔注射500 μL 高壓滅菌的石蠟油,5 d 后腹腔注射處于對數生長期的雜交瘤細胞1 ×106—2 ×106個∕只,5—7 d 后,選擇腹腔明顯膨脹,行動不便的小鼠,將注射器針頭插入小鼠腹腔內取腹水。 4 ℃、12 000 r∕min 離心15 min,去除雜質。 逐滴加入飽和硫酸銨,慢慢攪拌2 h,4 ℃、12 000 r∕min 離心15 min,棄上清,沉淀用0.01 mol∕L 的PBS(pH 7.2)重懸。 利用Protein G Resin 純化單克隆抗體,紫外吸收法測定濃度,SDS-PAGE 電泳分析其純度。

1.7 MAb 效價測定

利用2 μg∕mL 雞蛋溶菌酶包被酶標板,細胞培養上清和小鼠腹水做連續倍比稀釋,用ELISA 方法測定上清和腹水中MAb 的效價。 陰性對照是SP2∕0 細胞上清及免疫前小鼠血清。 P∕N 不低于2.1 者視為陽性。

1.8 單抗亞型鑒定

選用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,根據操作說明使用ELISA 方法鑒定單抗亞型。

1.9 MAb 特異性鑒定

1.9.1 ELISA 方法

雞蛋溶菌酶和CD163 截短蛋白M-1(對照蛋白)以2 μg∕mL 濃度包被酶標板,SP2∕0 細胞培養上清為陰性對照,每孔100 μL,常規間接ELISA 方法檢測該MAb 的抗原特異性。

1.9.2 Weston Blot 方法

8 μg 雞蛋溶菌酶經SDS-PAGE 電泳分離,電轉移至PVDF 膜上,4 ℃封閉過夜。 3E4 單克隆抗體作為一抗,HRP 標記羊抗鼠IgG 作為二抗,DAB 顯色,Western Blot 鑒定該MAb 的抗原特異性。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清抗體效價的檢測

采集3 只小鼠三免后第14 天的血清。 將免疫前采集的血清(Pre)、三免后采集的血清分別稀釋102倍、103倍、104倍和105倍,檢測其抗雞蛋溶菌酶抗體的效價。 由圖1 可知,三次免疫后,小鼠血清抗體水平均達到1.0 ×105,加強免疫后可以進行細胞融合。

2.2 雜交瘤細胞株的建立及MAb 亞型鑒定

三次細胞融合的融合率分別為17.7%、19.4%和78.2%,經過篩選、克隆等,最后獲得一株特異性和親和力高,并能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株,命名為3E4。 使用小鼠MAb 亞型鑒定試劑盒檢測,經酶標儀讀取450 nm 處吸光度值,判定3E4 抗體屬于IgG2b 亞型(表1)。

圖1 三免后小鼠血清抗體效價的ELISA 檢測Fig.1 ELISA detection of mouse serum after 3rd immunization

表1 MAb 亞型鑒定Table 1 MAb subtype identification

2.3 MAb 的效價測定及分離純化

收取單抗3E4 小鼠腹水16 mL。 細胞培養上清和腹水中抗體效價分別可達到2 560和1.0 ×106。 腹水經Protein G Resin 純化,紫外分光光度計檢測得3E4 的抗體濃度為1.8 mg∕mL。 SDS-PAGE 分析顯示,純化后MAb 主要有兩條蛋白帶:分子量約為50 ku 的重鏈帶和25 ku 的輕鏈帶。

2.4 3E4 單抗的特異性檢測

由表2 可知,單克隆抗體3E4 與雞蛋溶菌酶蛋白相互作用,與M-1 蛋白不相互作用,說明3E4 單抗具有較高抗原特異性。 Western Blot 結果顯示3E4 與雞蛋溶菌酶特異性結合(圖2)。 綜上,認為3E4 單克隆抗體具有高度的抗原特異性。

表2 單抗特異性的間接ELISA 方法檢測(OD450 nm)Table 2 Detection of MAb specificity by iELISA(OD450 nm)

圖2 Western blot 檢測MAb 的抗原特異性Fig.2 Detection the specificity of MAb by Western blot

3 討論與結論

溶菌酶在自然界中分布甚廣,動物(鳥類、家禽的蛋清和哺乳動物的眼淚、唾液、血漿、乳汁、胎盤以及體液、組織細胞等),植物(卷心菜、蘿卜、無花果)和微生物中處處可見[18]。 溶菌酶作為生物體內非特異性免疫的主要成員之一,具有與抗生素不同的抗菌機制和抑制病毒作用,其對人體無毒性,在體內無殘留,是一種安全性非常高的食品保鮮劑、營養保健品和藥品。 在倡導綠色食品的今天,受到人們越來越多的關注和重視,具有相當廣闊的應用前景[19]。 蛋清中溶菌酶含量越高,其酶活力越強,越利于雞蛋的保存。 因此測定雞蛋蛋清中溶菌酶對我國溶菌酶生產、禽蛋產品加工以及蛋品質評價具有重要的指導作用[20]。 瓊脂板擴散法、比濁法和酶聯免疫吸附(ELISA)方法是比較常用的溶菌酶檢測方法。 瓊脂板擴散法因測定時間長,操作復雜,靈敏度低,目前已少用[21]。 比濁法主要是檢測溶菌酶的活性,而不是溶菌酶的凈含量。 雖然可以根據所用標準品的活力進行轉換,但是不同物種的溶菌酶分子量和活力不同,根據標準品的活力進行轉換,其結果不夠精準;同時,比濁法使用的微球菌懸液體是不均勻體系,測定結果重復性較差[22-23]。 ELISA 方法是利用免疫反應(即抗原—抗體反應)的高度特異性和酶促反應的高度敏感性,實現對抗原或抗體的檢測,是一種定性和定量相結合的技術。 本研究是利用溶菌酶抗原與溶菌酶特異性抗體進行抗原抗體特異性反應,且反應顏色深淺和樣本中溶菌酶濃度呈比例關系的原理來測定溶菌酶凈含量。 ELISA 方法測定結果的變異系數較小,且易于實現批量檢測,具有微量、特異、高效、經濟、方便和安全等特點。 本試驗獲得了一株抗雞蛋溶菌酶的高特異性單克隆抗體,為ELISA 檢測方法的建立提供了關鍵的素材,為后期制備檢測雞蛋溶菌酶含量的ELISA 試劑盒奠定了基礎。