缺氮處理禾谷鐮刀菌在氮素恢復后的致病力變化

柴喜存，周天宇，馬海霞，王世鵬，劉玉濤

（南京農業大學工學院，南京 210031）

0 引 言

秸稈還田具有明顯改善土壤理化性質的作用[1-2]，有研究表明其可以代替施用腐熟有機肥作為提升土壤肥力的有效措施[3]；然而秸稈堆漚或過腹還田會增加收儲等各環節作業成本1 095～1 380元/hm2，經濟性較差[4]；而直接原位還田又由于腐解緩慢、積溫不足無法殺滅秸稈攜入土中的病原菌，導致作物病害高發[5-7]，這嚴重影響了農民秸稈還田的積極性，因而過剩秸稈仍是農業生產過程中亟待解決的問題[8]。

目前秸稈還田對植物病原菌的影響存在較大爭議。Huang等[9]研究發現小麥秸稈、花生殼等7種有機物料還田后能在一定程度上抑制棉花枯萎病的傳播；也有研究表明[10]通過有機物料的添加配合土壤pH值的調控及作物輪作，能夠顯著降低枯萎病的嚴重程度；但也有大量研究表明[11-12]秸稈還田是農作物病害高發的主要原因之一。研究認為有機物料的成分及腐熟程度[13]、微生物拮抗劑[14-15]、真菌毒性化合物[16-17]或營養[18]等的不同是作用效果出現較大差異的原因。目前關于氮素施用策略對病原菌產毒致病影響的研究較少，Cloud等[19]研究發現氮肥施用對菜豆殼球孢菌的定殖有顯著性影響；Heier等[20]研究發現氮肥施用會提高赤霉病發生的嚴重程度以及真菌毒素的積累；但前述研究因缺少對關鍵指標的表征，存在因年份、氣候等不同而結論差別較大的情況。秸稈還田會導致土壤內可利用氮素的量發生變化，Chai等[21]研究發現還田初期土壤內氮素缺乏能夠提高病原菌的毒素產量和致病能力；而隨著秸稈的分解和氮肥的補入，土壤中氮素含量提升對病原菌致病力的影響如何，尚缺少相關報道。

赤霉?。‵usariumhead blight，FHB）是嚴重影響小麥產量和品質的一種世界性病害，而隨麥秸稈還田攜入土中的禾谷鐮刀菌是赤霉病的主要病原菌[22]。在中國長江中下游麥區，由于茬口緊，直接原位還田是小麥秸稈處置的重要方式，這為赤霉病的發生創造了條件[23]。因而本研究通過室內模擬小麥秸稈還田后土壤內有效態氮素的固持和釋放過程，研究該過程對禾谷鐮刀菌的毒素產量、致病能力、生長量及孢子萌發等的影響，以期闡明秸稈還田后病害高發的原因并為合理施肥策略的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

禾谷鐮刀菌菌株（Fusarium graminearum, F.graminearum）由南京農業大學植物保護學院周明國教授提供；小麥品種：魯原502，赤霉病高度敏感，購自江蘇省農業科學院；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）標準品為分析純，購自SUPELCO（產品號：CRM46911，Bellefonte，PA，美國）；其他化學試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

基礎培養基（MM-N）：磷酸氫二鈉12.8 g，磷酸二氫鉀3.0 g，氯化鈉0.5 g，氯化銨1.0 g，葡萄糖5.0 g，加入1 L去離子水，121 ℃高壓滅菌20 min后加入2 mL 1 mol/L無菌硫酸鎂和0.1 mL 1 mol/L無菌氯化鈣溶液。

小麥培養基：將小麥粒于去離子水中浸泡2 h，再用去離子水煮30 min，風干5 h，最后使用粉碎機將小麥粒粉碎；取15 g小麥粒粉于100 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌15 min。

1.2 試驗設計及過程

本研究設置5個培養基N處理，調節MM-N培養基中氯化銨添加量以模擬環境中不同缺氮程度。5個處理氮素占比分別為0、25%、50%、75%和100%，其中100% 表示不缺氮處理，培養基中氯化銨濃度為1.0 g/L，其他處理按照比例添加相應量。每個N處理設置3個重復。

整個試驗過程分為以下3個階段：

1）菌絲培養：取0.5 cm×0.5 cm禾谷鐮刀菌菌絲塊接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養基（Potato Dextrose Agar Liquid Medium，PDA）中培養72 h。

2）缺氮處理階段：將菌絲經10 000 r/min離心10 min、無菌水沖洗后轉移至5個不同N處理的MM-N培養基中培養168 h。

3）氮恢復階段：收取缺氮處理階段培養168 h后的菌絲，以10 000 r/min離心10 min，然后取相同量菌絲轉移至MM-N全氮培養基中，并在0、2、24、48、72 h時取樣，以用于生長量、毒素產量和侵染能力等指標的測定。

1.3 分析方法

1.3.1 禾谷鐮刀菌生長情況測定

取5 mL菌液10 000 r/min離心10 min，去除上清液，使用天平稱量濕菌絲質量，計算禾谷鐮刀菌生長量。

式中M為單位體積（每毫升菌液中）菌絲的質量，g/mL；M1為菌絲和離心管的總質量，g；M2為離心管質量，g。

1.3.2 分生孢子萌發率測定

通過血球計數板對不同氮素水平處理168 h后的禾谷鐮刀菌產孢數量進行計數；氮素恢復48 h后，取40μL菌液，在顯微鏡下對孢子萌發情況進行測定，分生孢子萌發率的計算公式如下：

式中Cgr為分生孢子萌發率，%；Cg為觀察區域萌發的分生孢子個數；T是觀察區域分生孢子的總數。

1.3.3 禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素產量測定

禾谷鐮刀菌毒素的獲取采用室內接種小麥粒的方式，利用高效液相色譜儀（HPLC，LC-20A，Shimadzu，日本）進行毒素測定[24]；取0.2 g禾谷鐮刀菌菌絲，加入3 mL無菌水后混勻，用于產毒及侵染能力的測定；取0.75 mL菌液接種至小麥培養基后，置于28℃恒溫箱中培養10 d；然后進行毒素的提取和測定。

毒素的提取：小麥培養基中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）毒素的提取參考Femenias等[25]的方法并略有改進。取3.0 g小麥培養基，加入1.25 g聚乙二醇和25 mL去離子水，渦旋3 min，靜置；再渦旋3 min，將 DON 完全浸出。以10 000 r/min離心10 min，取10 mL上清液以1滴/s的流速通過免疫親和柱（產品號：IAC-030-3，PriboFast，中國）；再用10 mL 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）和10 mL去離子水先后淋洗免疫親和柱，流速為1～2滴/s，棄去全部流出液，抽干免疫親和柱；加入2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，收集全部洗脫液；在50℃下用氮氣將洗脫液吹干，加入1.0 mL 18%（體積比）的甲醇水溶液，渦旋30 s以溶解殘留物；經0.45μm微孔濾膜過濾，將濾液收集于進樣瓶中備測。

毒素的測定：利用高效液相色譜進行測定，其工作條件：檢測器為二極管陣列檢測器（DAD，SPD-M20A，Shimadzu，日本）；色譜柱為150 mm×4.6 mm的C18柱（產品號：5020-01731，GL Science，日本）；流動相為18%（體積比）的甲醇水溶液；柱溫為35 ℃；進樣量為20μL；運行時間為15 min。

1.3.4 禾谷鐮刀菌侵染能力測定

采取室內接種小麥苗的方式測定禾谷鐮刀菌的侵染能力，以小麥苗的病變長度作為檢測指標。取40μL上述菌液滴在脫脂棉上，并將吸有菌液的脫脂棉包裹在距離小麥苗（4～5 cm高）根部1.5 cm處的接種點，室溫培養并保持脫脂棉濕度在65%左右；4 d后，使用數顯游標卡尺測量接種位置的病變長度。

1.4 數據處理

研究中所有試驗重復3次。利用Excel 2013、SPSS Statistics 25.0等軟件進行數據處理分析；差異顯著性檢驗使用Duncan法（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 缺氮處理禾谷鐮刀菌氮素恢復后的生長和孢子萌發情況

生長及分生孢子的萌發在病原菌侵染作物的過程中具有重要的作用[26]，禾谷鐮刀菌缺氮培養168 h再氮素恢復后（0～72 h）菌絲生長情況如圖1所示。由圖可見，缺氮處理后的禾谷鐮刀菌在氮素恢復2 h時，雖然各處理的單位體積菌絲質量（簡稱菌絲質量，下同）變化均較小，但已表現出明顯差異，其中完全缺氮處理（即氮素占比為0）的菌絲質量為0.194 g/mL，顯著高于其他處理（P＜0.05）；而氮素占比100%處理的菌絲質量最低（P＜0.05），僅為0.127 g/mL菌液；在氮素恢復24 h時，各處理的生物量均有大幅度提升，完全缺氮處理的菌絲質量較轉入初期提高了107.87%，達到了0.354 g/mL菌液，明顯高于其他處理，說明完全缺氮處理在氮素恢復后具有很強的生長能力。隨著培養的進行，由于過快生長對環境營養的消耗以及菌體死亡、自溶等原因，各處理間單位體積的生物量差別越來越小，培養至48 h時，各處理單位體積的菌絲質量已無明顯差別；但在氮素恢復72 h時，氮素占比25%處理的單位體積的菌絲質量顯著高于其他處理（P＜0.05）。這一結果說明氮素恢復后由于生長速率等的不同會消除前期缺氮處理造成的生長差異。

不同氮素水平處理禾谷鐮刀菌168 h后的分生孢子產量及氮素恢復后48 h孢子的萌發情況如表1所示。由表可見，完全缺氮處理的分生孢子產量最低，僅為8.2×105個/mL，顯著小于其他處理（P＜0.05）；氮素占比75%處理的分生孢子產量最高，達到了4.18×106個/mL，顯著高于其他處理（P＜0.05）。不同處理間分生孢子的萌發率有明顯差別，其中完全缺氮處理產生孢子的萌發率顯著高于其他處理，為46.00%（P＜0.05）；而不缺氮處理產生的孢子萌發率最低，僅為3.00%（P＜0.05）。由分生孢子的數量與萌發率相乘，得到5種不同處理萌發的孢子數量分別為377 200、698 754、159 536、320 606和87 900個/mL，這意味著如果不考慮原有菌絲的活力，則完全缺氮處理和氮素占比25%處理在氮素恢復后具有較大的生長潛力。這充分說明不同缺氮處理對氮素恢復后禾谷鐮刀菌的孢子萌發及生物量增長具有重要影響。

從氮素恢復后的孢子萌發以及生長情況來看，不同程度缺氮處理在氮素恢復后具有明顯不同的生長速率，高的分生孢子萌發率可能是前期完全缺氮處理生長量較大的原因。

表1 缺氮處理對禾谷鐮刀菌分生孢子產量及萌發率的影響Table 1 Effects of nitrogen deficiency treatments on production and germination rate of F. graminearum spore

2.2 缺氮處理禾谷鐮刀菌氮素恢復后產毒能力的變化情況

DON是禾谷鐮刀菌產生的真菌毒素之一，能夠促進鐮刀菌對禾本科植物的侵染[27]，研究以DON的含量為檢測指標，來確定氮素恢復對缺氮處理禾谷鐮刀菌產毒能力的影響。氮素恢復后禾谷鐮刀菌的產毒能力變化情況如表2所示，由表可以看出，完全缺氮處理（即氮素占比為0）在氮恢復初期的毒素產量較高，達到了0.200μg/g；恢復至2 h時，未檢測到DON毒素；而后毒素的產量略有提升；但在整個氮素恢復的72 h內，完全缺氮處理的產毒能力較低。氮素占比25%處理在氮素恢復24 h時DON毒素產量達到1.361μg/g，顯著高于同時間的其他處理（P＜0.05）；氮素占比50%、75%和100%處理均在氮素恢復后72 h毒素產量最大，分別達到了0.515、1.409和0.540μg/g。這一結果說明完全缺氮處理禾谷鐮刀菌氮恢復后的產毒能力受到了明顯的影響，而其他處理則在氮消耗到一定程度時達到最高產毒能力。

表2 不同缺氮處理氮素恢復后0～72 h禾谷鐮刀菌的產毒量Table 2 Deoxynivalenol (DON) production of F. graminearum under different nitrogen deficiency treatments from 0-72 h after nitrogen recovery

2.3 缺氮處理禾谷鐮刀菌氮素恢復后侵染能力的變化情況

侵染能力與病原菌的致病力密切相關，研究以不同程度缺氮處理的禾谷鐮刀菌氮素恢復后侵染麥苗的長度作為判斷侵染能力的依據，其變化情況如表3所示。由表可以看出，完全缺氮處理（即氮素占比為0）禾谷鐮刀菌168 h后即氮恢復開始時，其侵染能力較弱，侵染長度僅為4.19 mm，顯著低于其他處理（P＜0.05）；24 h后隨新生菌絲的增多，其侵染能力得到一定程度的提升，至48 h時，侵染長度達到了8.93 mm；氮素恢復72 h時，小麥苗病變長度為7.73 mm，顯著低于氮素占比25%、50%和100%處理（P＜0.05）。氮素占比100%處理在氮恢復的初期侵染長度較高，達到了13.28 mm；而后在2～48 h的侵染長度大幅度下降，在72 h又上升為11.96 mm。氮素占比25%、50%和75%這3個缺氮處理均在氮恢復后的24 h時侵染長度達到最低，而后又提升，至72 h時達到最大值。這說明不同氮素占比處理的禾谷鐮刀菌在氮素恢復的初期侵染能力會有所降低；而隨著氮素的消耗，其侵染能力會提高。

表3 不同缺氮處理氮素恢復后0～72 h禾谷鐮刀菌的侵染長度Table 3 Lengths of infected lesions caused by F. graminearum under different treatments from 0-72 h after nitrogen recovery

3 討 論

大量研究表明氮元素和植物病害及其抗性間有著密切的關系[28]；秸稈還田能夠改變土壤碳氮組成和土壤微域環境，從而影響其中微生物的種群結構及生理功能[29]。由于微生物分解秸稈需要從土壤中吸收一定量的氮素[18]，因此單純秸稈還田會提高土壤氮素的礦化速度[30]，顯著降低土壤銨態氮和硝態氮的含量[31]，降低耕層土壤氮的有效性[32]。有研究表明不同形態的氮素能夠影響香蕉枯萎病的發病率和嚴重程度[33]，但不同報道間結果并不完全一致[28]。本試驗著重研究了氮素缺乏對禾谷鐮刀菌致病性的影響，發現在氮素完全恢復后，經受完全缺氮處理168 h的病原菌其分生孢子萌發率達到46.00%，顯著高于其他氮素水平，這可能是由于長時間的缺氮處理耗盡了病原菌內的含氮化合物，使得外源氮素成為了孢子萌發的必要條件導致的[34]。研究對秸稈還田后土壤內氮素的供應情況進行了細分，發現完全缺氮處理病原菌的產毒量以及侵染小麥苗的長度處于較低水平；部分缺氮或不缺氮處理在氮素恢復的初期，產毒和致病能力均有所降低，但隨著培養的進行，由于培養基中氮素的消耗，會使得禾谷鐮刀菌產毒和侵染能力再度得到提升；這能很好解釋Heier等[20]發現的氮肥施入對赤霉病作用效果迥異的原因。研究結果充分說明秸稈還田后氮素含量變化在病原菌致病力變化中起著非常重要的作用，因而從生產實際來看，秸稈還田初期施入充足的氮肥或后期追施足夠的氮肥，將有利于病害的控制。

以往研究對氮素與病原菌致病力間的關系得到了不同甚至完全相反的結論，有學者提出可能是氮素形態、病原菌類型以及氣候等因素的不同導致了上述差異[28]，卻忽視了氮素變化對病原菌自身生理的影響。秸稈還田后的氮素缺乏環境極易誘導病原真菌發生細胞自噬[35]，而細胞自噬是表征真核生物響應微域環境可利用氮素的重要指標，有研究也發現秸稈腐解會誘導里氏木霉的7種自噬相關基因表達上調[36]。因而，與氮素代謝密切相關的細胞自噬在禾谷鐮刀菌致病力變化中的作用有必要進一步闡明，這有可能為秸稈還田后植物病害的控制提供嶄新思路。

4 結 論

1）氮素恢復后，完全缺氮處理和氮素占比25%處理的分生孢子具有較高的萌發能力，菌液中萌發的孢子數量分別為377 200、698 754個/mL，高于其余處理；高的孢子萌發率是完全缺氮和氮素占比25%處理生長量較大的原因。原有菌絲的活力能夠保持部分缺氮處理（即氮素占比為50%和75%）和不缺氮處理的生長潛力；因而氮素恢復能夠消除不同程度缺氮處理對禾谷鐮刀菌生長的影響。

2）禾谷鐮刀菌在氮素恢復后，其產毒和侵染能力會短暫下降；但隨著氮素的消耗，禾谷鐮刀菌的產毒和侵染能力會再度得到提升；表明恢復后氮素的消耗情況對禾谷鐮刀菌的侵染能力具有較大的影響。

本研究涉及的缺氮處理與氮素恢復處理，分別與還田后秸稈腐解驅動的土壤內氮素固持與釋放相對應；研究發現的氮素恢復后經缺氮處理禾谷鐮刀菌的產毒和致病力變化規律，為秸稈還田后合理肥籌策略的制定提供理論依據：即在秸稈還田過程中施入或追施充足的氮肥，縮短病原菌處于部分缺氮狀態的時間。