PKM2在克羅恩病組織中的表達及意義

張 磊 楊 琳 王宏彬 周 怡

克羅恩病(CD)是一種炎癥性腸病，目前病因尚未完全闡明[1]。CD的病變特點為腸道炎性反應遷延不愈，且多累及回腸末端，嚴重時可并發腸狹窄、梗阻、穿孔或肛周病變[2-3]。盡早評估CD患者疾病嚴重程度及預后對后續治療具有重要意義。白細胞計數、C反應蛋白等炎性反應指標可評估CD疾病嚴重程度，但敏感度或特異度較低[4]。因此，亟需探究能夠準確評估CD患者疾病嚴重程度及預后的生物標志物。腸黏膜在阻止胃腸道病菌侵入機體及維持全身免疫系統方面發揮著重要作用。CD發病時可使腸黏膜受損而發生炎性反應，致使腸上皮細胞凋亡。研究表明，M2型丙酮酸激酶(PKM2)的上調可通過調控B細胞淋巴瘤-XL(Bcl-XL)蛋白表達保護腸上皮細胞，使其免于凋亡[5]。本文檢測了CD組織中PKM2蛋白的表達水平，并探究其評估CD患者疾病嚴重程度和預后的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年3月至2017年8月在上海市浦東新區浦南醫院就診的126例CD患者作為研究對象，設為CD組。根據《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》[6]中關于CD診斷的相關內容進行診斷。納入標準：(1)年齡18～60歲；(2)接受結直腸鏡檢查；(3)簽署了知情同意書。排除標準：(1)合并除CD以外的自身免疫性疾病；(2)入組前服用過抗炎藥物；(3)合并嚴重心、肝、腎等臟器功能異常；(4)合并急性感染性腸炎；(5)合并惡性腫瘤；(6)不能配合隨訪。另選取同期在本院接受結直腸鏡檢查并切除腸息肉組織的52例患者作為對照組。CD組中男性81例，女性45例，年齡28～54歲，平均年齡為(40.25±5.45)歲；對照組中男性33例，女性19例，年齡29～50歲，平均年齡為(38.64±4.28)歲。兩組的性別(χ2=0.011，P=0.917)、年齡(t=0.720，P=0.472)相比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集受試者的年齡、性別、吸煙史、病變位置、上消化道受累、C反應蛋白、紅細胞沉降率、疾病行為和肛周病變等臨床信息。C反應蛋白>8 mg/L定義為升高，紅細胞沉降率>15 mm/h定義為升高。

1.2.2 PKM2蛋白表達水平檢測 采用蛋白質印跡法檢測CD組織及息肉組織中PKM2蛋白表達水平[7]。于結直腸鏡檢查時留取受試者CD組織和息肉組織的病理標本，將RIPA裂解液分別滴加至盛有CD及息肉組織的容器中，提取總蛋白，采用BCA法進行定量。然后，滴加勻漿緩沖液在4 ℃的離心機中以3 500 r/min離心15 min，取上清液。電泳100 min至溴酚藍跑出膠面，緩沖液漂洗，浸入轉膜緩沖液中轉膜。PBS洗膜，加入兔抗人PKM2抗體(購自武漢益普生物科技有限公司)，4 ℃孵育過夜。PBST漂洗，加入山羊抗兔二抗(購自武漢益普生物科技有限公司)，室溫孵育1 h。曝光顯影，采用ImageJ軟件進行光密度分析。

1.2.3 CD疾病嚴重程度評估 采用CD簡化內鏡評分(SES-CD)評估CD患者的疾病嚴重程度[8]。SES-CD評分將腸道分為末端回腸、右半結腸、橫結腸、左半結腸和直腸5個部分，參考以下4個維度：潰瘍大小、潰瘍面積、受累腸道面積及腸腔狹窄情況，各維度評分均為0～3分，分數越高表示越嚴重。SES-CD 評分為各維度評分之和，0～3分為緩解，4～10分為輕度活動，11～19分為中度活動，20分及以上為重度活動。

1.2.4 預后評估 采用電話隨訪方式了解CD患者的預后情況。CD患者出院3個月后開始隨訪，了解其2年內的并發癥、手術及CD相關死亡情況，隨訪終點為患者死亡或末次隨訪時間(2019年8月20日)。將發生腸瘺、復雜肛瘺、腸穿孔、消化道大出血、腹腔膿腫、腸梗阻等并發癥，接受腸切除手術治療，以及CD相關死亡判定為預后不良[9]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PKM2在CD組織中的表達

CD組PKM2蛋白的相對表達量為0.47±0.11，低于對照組(1.08±0.14)，兩組差異有統計學意義(t=31.250，P<0.001)。

2.2 PKM2與CD疾病嚴重程度的關系

CD組患者平均SES-CD評分為(8.85±2.41)分。Pearson相關性分析結果顯示，CD組患者PKM2蛋白表達水平與SES-CD評分呈負相關關系(r=-0.891，P<0.001)。見圖1。

圖1 PKM2與SES-CD評分關系的散點圖

2.3 PKM2在不同預后的CD患者中的表達

隨訪發現，126例CD患者中有40例(31.75%)預后不良，包括5例(3.97%)腸瘺，6例(4.76%)復雜肛瘺，3例(2.38%)腸梗阻，4例(3.17%)腹腔膿腫，3例(2.38%)消化道大出血，19例(15.08%)接受腸切除手術治療。預后不良的CD患者PKM2蛋白相對表達量為0.34±0.05，低于預后良好的CD患者(0.53±0.08)，兩組差異有統計學意義(t=16.432，P<0.001)。

2.4 PKM2與CD患者預后的關系

預后不良患者和預后良好患者在年齡、性別、吸煙史、病變位置、上消化道受累、C反應蛋白和紅細胞沉降率方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)；在疾病行為和肛周病變方面比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

將可能與CD患者預后有關的因素，包括上消化道受累(非上消化道受累=0，上消化道受累=1)、疾病行為(非狹窄非穿透型=0，狹窄型=1，穿透型=2)、肛周病變(非肛周病變=0，肛周病變=1)和PKM2蛋白表達水平(原始值錄入)作為自變量，納入標準α≤0.1，將CD患者的預后情況作為因變量，納入多因素Logistic回歸模型分析，結果顯示疾病行為、肛周病變和PKM2蛋白表達水平與CD患者預后關系密切(P<0.05)。見表2。

表1 影響CD患者預后的單因素分析

表2 影響CD患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

CD發病過程中，白細胞計數、C反應蛋白、血小板計數、紅細胞沉降率、血紅蛋白和白蛋白水平等炎性反應指標將發生變化，但上述指標在判斷CD疾病嚴重程度方面存在不足，敏感度或特異度較低，臨床價值有限[10-16]。結直腸鏡檢查是評估CD疾病嚴重程度的金標準，但患者接受度較低，操作較為繁瑣，且難以多次進行。因此，探尋敏感度和特異度均較高且操作便捷的指標尤為重要。

PKM2是一種糖酵解關鍵代謝酶，在機體內以二聚體或四聚體形式存在[17]。二聚體的活性較低，主要存在于腫瘤細胞中；而四聚體的活性較高，主要存在于正常的、處于增殖狀態的細胞中[18]。研究表明，PKM2可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為乳酸，同時生成三磷酸腺苷，維持細胞增殖和代謝[19-21]。此外，PKM2還可以調控Wnt/β-catenin信號通路及Bcl-XL蛋白表達，從而抑制細胞凋亡[5,22]。

本研究結果顯示，CD組PKM2蛋白的表達水平低于對照組，提示PKM2可能與CD的發病有關。SES-CD評分可反映CD患者的疾病嚴重程度。本研究發現，PKM2蛋白表達水平與SES-CD評分呈負相關關系，提示PKM2可能參與了CD的疾病進展過程。基于上述結果，本文比較了不同預后的CD患者PKM2蛋白表達水平，結果顯示預后不良CD患者的PKM2蛋白表達水平低于預后良好者，提示PKM2與CD患者的預后密切相關。多因素Logistic回歸分析結果顯示，疾病行為、肛周病變情況和PKM2蛋白表達水平與患者的預后關系密切。

綜上所述，CD患者PKM2蛋白表達水平越低提示其病情越嚴重。狹窄型或穿透型CD、合并肛周病變及低PKM2蛋白表達水平的CD患者發生預后不良的風險較高。檢測CD組織中PKM2蛋白表達水平有助于評估CD患者的疾病嚴重程度和預后。本研究存在一定的不足之處，如入組患者的病程長短不一，可能使結果存在一定偏倚；未在治療過程中檢測CD組織中PKM2蛋白的表達水平，了解其動態變化及對療效的評估價值。今后將針對以上不足開展多中心研究和基礎研究，以闡明PKM2在CD發病及進展中的作用。