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枸杞多糖促進(jìn)慢性潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期小鼠結(jié)腸組織T re k1的表達(dá)

2021-05-08 06:38:04王鹓臻李亞俊
關(guān)鍵詞:小鼠質(zhì)量

王 芳,王鹓臻,吳 佳,李亞俊

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科,銀川 750004)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種腸道特發(fā)性炎癥性疾病,可引起結(jié)腸持續(xù)的黏膜炎癥,其活動(dòng)期具有典型的癥狀,如腹瀉、腹痛、黏液膿血便和體質(zhì)量減輕[1-2]。研究表明,枸杞多糖(lyciumbarbarum polysaccharide,LBP)具有廣泛的生物學(xué)特性,包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及腸道菌群的調(diào)控作用,對(duì)結(jié)腸炎的腸道癥狀具有一定的治療作用[3-4]。Trek1(TWIK-Related K+Channel 1)是雙孔結(jié)構(gòu)域(K2P)機(jī)械門(mén)控鉀通道,在結(jié)腸上皮細(xì)胞和平滑肌中特異性表達(dá),維持腸上皮屏障完整性并參與腸道收縮的調(diào)節(jié)[5-7]。LBP能否通過(guò)調(diào)控結(jié)腸組織中Trek1的表達(dá)改善UC活動(dòng)期癥狀尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究LBP對(duì)慢性UC模型鼠活動(dòng)期癥狀的改變以及Trek1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響,以期為L(zhǎng)BP緩解活動(dòng)期慢性UC的機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器

葡聚糖硫酸酯鈉鹽(DSS)(MP生物醫(yī)學(xué)公司);LBP(百瑞源,含量≥50%);聯(lián)苯胺(艾科試劑);總RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒(賽默飛世爾公司);熒光定量PCR儀(賽默飛世爾公司);兔抗Trek1/β-actin抗體、HRP-山羊抗兔抗體(Abcam公司)。

1.2 各組小鼠模型的制備

18只6~8周C57BL/6小鼠,體質(zhì)量20 g左右,SPF級(jí),隨機(jī)分為正常組、造模組和治療組,每組6只。正常組小鼠飲用dH2O 25 d,無(wú)特殊處理;造模組和治療組小鼠第1~5、第11~15、第21~25天飲用2%的DSS,制備慢性UC小鼠模型并模擬慢性UC活動(dòng)期;治療組小鼠從第6天開(kāi)始,每天給予200 mg·(kg·d)-1的LBP灌胃。各組小鼠第0、5、10、15、20、25天時(shí)測(cè)量體質(zhì)量、評(píng)估肛周及收集糞便情況。造模組和治療組小鼠第5天體質(zhì)量和疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則提示小鼠模型制備成功。

1.3 DAI評(píng)分

各組小鼠于第0、5、10、15、20、25天時(shí)監(jiān)測(cè)體質(zhì)量、腹瀉及便血情況,并計(jì)算DAI評(píng)分。體質(zhì)量:相較于正常組小鼠體質(zhì)量,造模組和治療組小鼠體質(zhì)量變化<1%(0分),1%~5%(1分),5%~10%(2分),10%~20%(3分),>20%(4分)。小鼠大便性狀:正常便(0分),干燥小粒狀;半稀便(2分),糊狀便但不粘肛門(mén);稀便(4分),液狀便并粘肛門(mén)。大便隱血:陰性(0分),陽(yáng)性(2分),肉眼血便(4分)。三項(xiàng)評(píng)分之和即為DAI評(píng)分。小鼠UC病情越重,則DAI評(píng)分越高。

1.4 大便隱血的檢測(cè)

采用聯(lián)苯胺冰醋酸法,在收集好的糞便上先后各滴加2滴聯(lián)苯胺冰醋酸液和過(guò)氧化氫后,觀察糞便顏色變化,2 min內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色則為陽(yáng)性,未變色則記為陰性,明顯大便帶血和肛門(mén)處血跡評(píng)定為肉眼血便。

1.5 結(jié)腸組織的分離和總RNA、總蛋白的提取

于實(shí)驗(yàn)第26日清晨采用斷頸法處死小鼠后取小鼠結(jié)腸組織,剪碎后按說(shuō)明書(shū)(總RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒)步驟提取總RNA、總蛋白,然后采用BCA定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量,最后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Trek1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

Trek1引物序列:上游序列5'-ACAGAACTTC ATAGCCCAGCAT-3',下游序列:5'-TCCCACCTCTTCCTTCGTCT-3',Tm 57℃;β-actin引物序列:上游序列5'-AGCGAGCATCCCCCAAAG-3',下游序列5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3',Tm 59℃。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),用5X All-In-One RT MasterMix(100×20 plrxns)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成Trek1的cDNA。在熒光定量PCR儀中進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。使用β-actin作為內(nèi)源參考基因。按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Trek1基因的變性、復(fù)性、延伸循環(huán)。然后計(jì)算2-ΔΔCt值,進(jìn)行Trek1的定量實(shí)時(shí)PCR分析。

1.7 Western blot檢測(cè)Trek1蛋白相對(duì)表達(dá)量

將提取的總蛋白進(jìn)行電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移,在5%脫脂奶粉中封閉1 h后,一抗雜交(兔抗Trek1抗體1∶1000中4℃孵育過(guò)夜),漂洗后二抗雜交(HRP-山羊抗兔抗體1∶5000室溫下孵育1 h),漂洗后ECL工作液溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min,顯影、定影,采用BandScan 5.0軟件分析條帶的光密度值,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Trek1蛋白相對(duì)表達(dá)量=(Trek1 OD值/β-actin OD值)×10。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行描述,組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP增加慢性UC小鼠的體質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)第5、10、15、20、25天,慢性UC小鼠(造模組)體質(zhì)量均輕于正常組(P均<0.001),提示慢性UC小鼠模型制備成功;實(shí)驗(yàn)第15、20、25天,治療組小鼠體質(zhì)量較造模組增加(P均<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 LBP對(duì)慢性UC小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 LBP降低慢性UC小鼠的DAI評(píng)分

實(shí)驗(yàn)第5、10、15、20、25天,慢性UC小鼠(造模組)DAI評(píng)分均高于正常組(P均<0.001)。實(shí)驗(yàn)第10、15、20、25天,治療組小鼠體質(zhì)量、腹瀉及肉眼血便情況較造模組明顯減輕,DAI評(píng)分均低于造模組(P均<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 LBP對(duì)慢性UC小鼠DAI評(píng)分的影響

2.3 LBP增加慢性UC小鼠結(jié)腸組織的Trek1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量

造模組小鼠結(jié)腸組織Trek1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.182±0.04)低于正常組(0.928±0.24),治療組Trek1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.762±0.037)高于造模組(P均<0.001),見(jiàn)圖3。造模組小鼠結(jié)腸組織Trek1蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.33±0.18)低于正常組(9.42±0.36),治療組Trek1蛋白相對(duì)表達(dá)量(7.22±0.12)高于造模組(P均<0.001),見(jiàn)圖4。

圖3 RT-qPCR檢測(cè)LBP對(duì)慢性UC小鼠Trek1mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

圖4 Western blot檢測(cè)LBP對(duì)慢性UC小鼠Trek1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

LBP是枸杞中提取的主要活性成分,具有調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗腫瘤、抗衰老等作用,目前在炎癥損傷的治療中應(yīng)用廣泛[8-13]。LBP的抗炎作用已在多種疾病中被證實(shí),如通過(guò)抑制炎性反應(yīng),對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用;能有效減輕膠原誘導(dǎo)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型骨損傷和骨丟失,同時(shí)減輕Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠炎性反應(yīng);能夠減輕IL-1β誘發(fā)的ATDC 5細(xì)胞(小鼠軟骨細(xì)胞)的炎性損傷[8-9,12]。本研究通過(guò)2%DSS制備慢性UC活動(dòng)期小鼠模型,200 mg·(kg·d)-1的LBP灌胃治療模型鼠,發(fā)現(xiàn)LBP能夠改善慢性UC的腸道炎癥損傷所引起的小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉和便血的典型癥狀,提示LBP能夠改善腸道炎癥所造成的結(jié)腸組織的損傷,為L(zhǎng)BP改善全身炎性反應(yīng)、緩解炎性反應(yīng)造成的不同器官損傷提供更多的支持。

目前仍不清楚UC的發(fā)病原因和機(jī)制,但其被認(rèn)為與基因、腸道菌群以及外部環(huán)境所導(dǎo)致的機(jī)體自身免疫失衡進(jìn)而引起的腸道炎性反應(yīng)密切相關(guān)[1]。目前治療策略主要通過(guò)5-氨基水楊酸等免疫抑制藥物、糖皮質(zhì)激素、英夫利昔單抗等局部或全身用藥,以抑制炎性反應(yīng),減輕腸道損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn),LBP能夠減輕腸道的炎癥損傷,并能夠促進(jìn)腸壁內(nèi)Trek1的表達(dá)。

Trek1是鉀離子通道,目前已發(fā)現(xiàn)其對(duì)器官功能的維持及器官上皮細(xì)胞穩(wěn)定性具有調(diào)節(jié)作用。例如,Trek1可調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞的牽張誘導(dǎo)脫離;過(guò)敏性鼻炎患者和大鼠的高通透性鼻黏膜中Trek1的表達(dá)較低,且炎癥因子IL-4可抑制Trek1的表達(dá);Trek1離子通道參與細(xì)胞膜機(jī)械敏感性的調(diào)節(jié),該離子通道對(duì)于懷孕期間子宮穩(wěn)定性的維持起到至關(guān)重要的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),LBP對(duì)Trek1蛋白與其mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)趨勢(shì)一致,即LBP可促進(jìn)活動(dòng)期潰結(jié)模型鼠結(jié)腸中Trek1的表達(dá),改善潰結(jié)癥狀,結(jié)合Trek1具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞穩(wěn)定性的功能,推斷LBP緩解潰結(jié)癥狀,可能與其通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮中Trek1的表達(dá)從而改善腸黏膜屏障功能有關(guān),該改善作用仍需要進(jìn)一步研究,才能明確LBP對(duì)潰結(jié)小鼠結(jié)腸上的炎性反應(yīng)、Trek1的表達(dá)以及腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)作用,從而為L(zhǎng)BP緩解活動(dòng)期慢性UC的機(jī)制研究及實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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