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遠端肢體缺血預處理對氯胺酮致發育期大鼠大腦皮層H M GB1和COX-2表達的影響

2021-05-08 06:38:02賈雲雲李安琪鄧立琴孟盡海
寧夏醫科大學學報 2021年3期
關鍵詞:劑量血清實驗

賈雲雲,李安琪,馬 萬,鄧立琴,孟盡海,張 春

(1.寧夏醫科大學臨床醫學院,銀川 750004;2.寧夏醫科大學總醫院麻醉科,銀川 750004;3.寧夏醫科大學顱腦疾病重點實驗室,銀川 750004)

氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)離子通道阻滯劑,被廣泛應用于危重患者和小兒麻醉手術。有研究[1]表明,在大腦發育早期暴露于氯胺酮可導致神經損傷,但氯胺酮導致神經損傷的機制尚不清楚[2]。也有研究表明,遠端肢體缺血預處理(remote limb ischemic preconditioning,RIPC)可通過再灌注早期激活自噬來減輕動物的大腦損傷,下調炎性因子,減少大腦梗死面積,降低腦水腫程度,改善神經功能紊亂[3-4]。但RIPC對氯胺酮所造成的神經毒性是否有保護作用,尚未見報道。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和環氧合酶-2(COX-2)是與神經炎性和神經變性相關的兩種常見炎性因子,可驅動包括認知能力下降在內的神經退行性疾病的發病因素,參與疾病的發生發展[5-6]。已有研究表明,大劑量氯胺酮暴露可致炎性因子表達失衡[7]。因此,本研究通過觀察RIPC對氯胺酮致發育期大鼠大腦皮質神經因子HMGB1和COX-2表達的影響,探討RIPC對氯胺酮損傷的發育期大鼠神經是否具有保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

5日齡健康新生SD大鼠48只(雌雄各24只),體質量7~13 g。新生SD大鼠和母鼠共同飼養在溫度(24±2)℃和濕度(50±5)%可控的室內,晝夜交替,母鼠自由喂養乳鼠。實驗動物購自寧夏醫科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號為SCXK(寧)2020-0001。

1.2 藥品與試劑

氯胺酮(福建古田制藥廠);Rabbit anti-COX-2、Rabbit anti-HMGB1(美國abcam公司,型號:ab15191,ab79823);細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ(COX-2)檢測試劑盒、HMGB1檢測試劑盒(武漢云克隆公司,型號:SED284Ra 96T,SEA399Ra 96T);免疫組化兔二步法檢測試劑盒(中杉金橋公司)。

1.3 實驗分組及方法

將5日齡大鼠隨機分為4組,每組12只(雌雄各6只),對照組(C組):出生第7天時經腹腔注射生理鹽水,劑量為8 mL·kg-1,每2 h注射1次,共連續注射6次,持續1 d;RIPC組:出生第5天時用紗布繩綁住右后肢根部,用拉力器拉伸2.5N后觀察肢體顏色變化,顏色發紺即為缺血,持續5 min后解開紗布繩,皮膚由發紺轉為潮紅,即為再灌注,持續5 min,共連續進行4個周期(缺血5 min,再灌注5 min為1個周期),48 h后經腹腔注射生理鹽水,劑量為8 mL·kg-1,每2 h注射1次,共6次;氯胺酮組(KTM組):出生第7天時經腹腔注射氯胺酮,劑量為20 mg·kg-1(用生理鹽水將氯胺酮溶液稀釋至2.5 mg·mL-1,注射容量為8 mL·kg-1),藥物注射后立即將大鼠放置于37℃恒溫保溫箱中,給予4 L·min-1低流量氧氣吸入,仔細觀察大鼠呼吸頻率及皮膚顏色的變化,氯胺酮共注射6次,每次間隔2 h;氯胺酮組+RIPC(K+R組):出生第5天時行RIPC,方法同RIPC組,48 h后給予氯胺酮注射,方法同KTM組。最后一次藥物注射完畢后,觀察動物變化,直至大鼠生命體征正常,條件反射完全恢復后,返回母鼠身邊喂養。

1.4 觀測指標

1.4.1 酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清中COX-2、HMGB1水平 每組隨機選取6只大鼠,末次藥物注射完成后12 h,采用水合氯醛麻醉,經心臟采血,室溫靜置后離心提取血清,采用ELISA試劑盒(武漢云克隆公司)進行檢測,實驗流程根據說明書進行,對比標準曲線分析各組大鼠血清中HMGB1、COX-2的濃度。

1.4.2 qRT-PCR法檢測大鼠大腦皮質中COX-2和HMGB1的mRNA表達 經1.4.1心臟采血后的大鼠,采用生理鹽水灌注心臟,于冰上斷頭取腦,分離大腦皮質組織于-80℃冰箱保存備用。制備大腦皮質勻漿液,提取總RNA,測定其濃度,然后將mRNA反轉錄為cDNA,-80℃保存備用。大鼠COX-2、HMGB1、GAPDH的基因引物序列均由上海生工設計和合成,見表1。于PCR儀上進行擴增,總反應體系是25μL,實驗過程嚴格依據說明書進行。各組大腦皮質HMGB1、COX-2的mRNA表達水平根據2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 Western blot法檢測大鼠大腦皮質中COX-2和HMGB1的蛋白表達 取1.4.2獲得的腦組織,采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,將提取后的蛋白離心,取上清液保存備用。采用標準BCA法測定蛋白濃度,取等量已定量的蛋白經10%SDS-PAGE電泳分離,濕轉膜法轉膜,牛奶封閉,加入兔抗COX-2抗體(1∶1000)、兔抗HMGB1抗體(1∶5000),4℃孵育過夜。經TBST洗膜后,分別加入相對應的二抗稀釋液,室溫下孵育75 min,TBST洗膜后使用ECL檢測試劑盒進行發光顯影,以GAPDH為內參,Image J軟件計算COX-2、HMGB1的表達水平。

1.4.4 免疫組化法檢測大鼠大腦皮質COX-2、HMGB1的表達水平 末次藥物注射完成12 h后,將每組剩余的6只大鼠用4%多聚甲醛經心臟灌注固定后,斷頭處死,于冰上取大腦組織石蠟包埋、切片,采用免疫組化兔二步法檢測試劑盒進行實驗,具體操作步驟參考說明書。通過分析軟件IPP6.0分析統計額葉大腦皮質HMGB1和COX-2陽性細胞占比,比較不同處理組間HMGB1、COX-2的陽性細胞占比。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析,符合正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中COX-2和HMGB1蛋白含量

ELISA檢測結果顯示,C組和RIPC組大鼠血清中COX-2、HMGB1蛋白含量差異均無統計學意義(P均>0.05),KTM組和K+R組血清中COX-2、HMGB1蛋白含量均較C組升高(P均<0.05);與KTM組相比,K+R組血清中COX-2、HMGB1含量均減少(P均<0.05),見表2。

表2各組大鼠血清中COX-2、HMGB1水平比較(±s,ng·mL-1)

表2各組大鼠血清中COX-2、HMGB1水平比較(±s,ng·mL-1)

與C組比較*P<0.05;與KTM組比較#P<0.05。

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2.2 各組大鼠大腦皮質中HMGB1、COX-2的mRNA水平比較

圖1各組大鼠大腦皮質中HMGB1的mRNA表達情況比較

qRT-PCR檢測結果顯示:與C組相比,RIPC組HMGB1、COX-2的mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05),KTM組和K+R組HMGB1、COX-2的mRNA表達均較C組及RIPC組升高(P均<0.05);與KTM組相比,K+R組HMGB1、COX-2的mRNA表達降低(P<0.05),見圖1、圖2。

2.3 各組大鼠大腦皮質HMGB1、COX-2的蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示,C組和RIPC組大腦皮質HMGB1、COX-2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與C組及RIPC組比較,KTM組和K+R組HMGB1、COX-2蛋白表達均升高(P均<0.05)。與KTM組比較,K+R組HMGB1、COX-2的蛋白表達均降低(P均<0.05),見圖3、圖4。

圖2 各組大鼠大腦皮質中COX-2的mRNA表達情況比較

圖3 各組大鼠大腦皮質HMGB1蛋白的表達情況比較

2.4 各組大鼠大腦皮質HMGB1和COX-2的陽性表達細胞

免疫組化檢測結果顯示,HMGB1表達在細胞核上,陽性細胞表現為細胞核內黃褐色顆粒沉積。COX-2表達在細胞質上,陽性細胞可見核周圍細胞質出現棕黃色顆粒沉淀;通過免疫組化染色可以觀察到各組大鼠大腦皮質中HMGB1和COX-2的表達和定位,C組和RIPC組大鼠大腦皮質HMGB1、COX-2免疫組化染色陽性細胞占比差異無統計學意義(P>0.05)。與C組及RIPC組比較,KTM組和K+R組HMGB1、COX-2陽性細胞占比均增高(P均<0.05)。與KTM組比較,K+R組HMGB1、COX-2陽性細胞占比均降低(P均<0.05),見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠大腦皮質HMGB1陽性細胞表達

3 討論

圖6 各組大鼠大腦皮質COX-2的陽性細胞表達

有研究[8]表明,常用的全身麻醉藥可能導致發育中的嚙齒類動物大腦功能的缺失,發生廣泛的神經細胞凋亡,從而降低神經傳導效率,引起持續性的學習和記憶能力下降等認知功能障礙[9]。已知NMDA受體在調節神經元的生存、遷移、突觸的形成中起著關鍵的作用[10-11]。NMDA受體激活是學習和記憶獲取并鞏固的重要步驟[12],NMDA表達減少在額葉皮層中觀察到受體和細胞凋亡,NMDA受體的阻斷會導致記憶障礙,并與一系列記憶性神經障礙密切相關。氯胺酮作為常見的全身麻醉藥品之一,被廣泛地應用于危重癥患者及嬰幼兒的手術麻醉,氯胺酮作為NMDA阻滯劑,可通過拮抗NMDA受體發揮其麻醉作用[13-14]。近年來,有研究報道大劑量、反復注射氯胺酮會降低哺乳類動物大腦皮質、海馬CA1區的神經密度和樹突棘密度,導致發育敏感期動物大腦皮質和海馬CA1區神經元的退行性變和神經細胞的凋亡[15],故本實驗選用新生大鼠大腦皮質作為研究標本。大腦發育敏感期反復暴露于大劑量氯胺酮會引起大量的神經細胞損傷和長期的認知功能障礙,其中出生后第7天對于嚙齒類動物而言為致麻醉神經毒性最為敏感的時期[16],故本實驗將新生第7天的大鼠作為研究對象。氯胺酮神經毒性的作用取決于暴露的時間和劑量,僅在高劑量重復注射和延長暴露時間的情況下觀察到了神經退行性病變[8],故本實驗采用氯胺酮20 mg·kg-1多次經腹腔注射觀察其促炎因子的變化。COX-2和HMGB1是常見的促炎因子,可驅動神經退行性疾病的發病因素,參與降低神經認知能力,被認為是與神經認知障礙相關的神經炎癥的常見生物標記物[17-18]。COX-2抑制劑對大腦皮質中促炎因子水平的增加有不同程度的衰減作用[19],抑制神經因子HMGB1的表達在神經退行性疾病中也具有神經保護作用[20]。有研究表明[7],大劑量、反復多次氯胺酮暴露于發育期嚙齒動物,可導致其炎性因子表達升高,加劇其炎性反應,故本實驗選用神經因子COX-2、HMGB1作為研究指標。該實驗選取出生第7天的大鼠作為研究對象,參照文獻[16]的實驗方法,經腹腔行氯胺酮20 mg·kg-1反復多次注射,觀察額葉大腦皮質和血清中神經炎性因子COX-2和HMGB1的表達情況。結果顯示,新生大鼠多次注射大劑量的氯胺酮可致神經因子COX-2、HMGB1表達增加。RIPC是一種依賴于機體對缺血/再灌注損傷內源性保護模式的現象,它是指預先給予一個組織或器官非致死性的局部缺血來誘導機體產生缺血耐受狀態,以保護遠隔的組織或器官對后期的致死性缺血產生抵抗力,從而發揮其保護作用,改善預后的操作。文獻[21]證實RIPC可通過誘導缺血耐受來刺激內源性保護機制,增加糖代謝,抑制細胞凋亡,降低腦缺血體積,改善紊亂的神經功能,從而減輕缺血腦卒中后缺血再灌注損傷。同時,RIPC可通過再灌注早期激活自噬來減輕大腦損傷,下調炎性因子,改善神經功能[3]。但RIPC是否對氯胺酮誘導的發育期大腦的神經毒性具有保護作用,目前尚未報道。本課題組推測RIPC可下調大劑量、反復多次氯胺酮暴露所致的神經炎性因子COX-2、HMGB1的表達,設計RIPC作為一種氯胺酮暴露的保護措施,于大鼠出生第5天行右后肢根部RIPC,48 h后暴露于氯胺酮,觀察RIPC對氯胺酮所致神經因子COX-2、HMGB1的增高是否具有下調作用。結合本研究結果顯示,大劑量、反復多次氯胺酮暴露可增高大腦皮質中神經因子COX-2和HMGB1的陽性占比、mRNA和蛋白表達水平及血清中的含量,但RIPC可減輕氯胺酮暴露所致的COX-2和HMGB1的變化,提示RIPC可通過調節神經因子COX-2和HMGB1的表達從而發揮神經保護作用,這一結果與RIPC誘導內源性神經保護機制的結論相吻合。

綜上所述,發育期大鼠多次暴露于大劑量的氯胺酮會引起大腦額葉皮層和血清中神經因子COX-2和HMGB1表達增高,RIPC可下調氯胺酮所致發育期大鼠大腦皮質和血清中神經因子COX-2和HMGB1表達的升高。RIPC對氯胺酮所致的神經損傷具有保護作用,可以為以后氯胺酮臨床麻醉提供新的臨床治療方案,從而減少麻醉藥對新生兒大腦損傷的影響。

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